ООО «Центр Грузовой Техники»

8(812)244-68-92

Содержание

Салонный фильтр Лада Гранта где находится: фото и видео

Автомобиль: Лада Гранта.
Спрашивает: Некипеллов Павел.
Вопрос: Где находится салонный фильтр на автомобиле Лада Гранта?


Купил Гранту с рук. Состояние не плохое, но с воздуховодов дует грязный воздух. Машина постояла день под тополями, включил печку, а на меня полетел пух и семечки тополиные. До этого у меня была старенькая Тойота, там салонный фильтр находится в бардачке, а тут я его в нём не нашел. Такое ощущение, что у меня вообще этот фильтр не установлен.

Местонахождение салонного фильтр на Лада Гранта

The following two tabs change content below.

Эксперт по автомобилям Лада с многолетним стажем. Владею автомобилем Лада Гранта, собираю корч на базе "Приоры". Иногда остаюсь с ночёвкой в гараже. Моя жена к автомобилям ревнует меня больше, чем к женщинам.

На рисунке видно расположение пластиковой заглушки под которой установлен салонный фильтр, также отмечено, какие болтики необходимо открутить

Фильтр находится под капотом слева (ближе к пассажиру). Между моторным отсеком и лобовым стеклом. Закрыт он декоративной заглушкой (пластмассой). Подробнее о замене салонного фильтра здесь.

Так выглядит болт крепления torx

Почему может отсутствовать фильтр?

Салонный фильтр устанавливается на всех автомобилях Лада Гранта не зависимо от его комплектации. Я встречал некоторые модели комплектации стандарт, в них салонного фильтра не было, но это были самые первые «пилотные» версии.

В вашем случае возможен вариант, что перед продажей салонный фильтр изъяли из автомобиля. Фильтр мог испортиться и «завоняться», в результате чего, стёкла на автомобиле будут сильно потеть. А зачем покупать новый фильтр, если автомобиль продаётся?

Артикулы фильтра для замены

Один из самых популярных заменителей оригинального салонного фильтра

Грантоводы с нашего сообщества рекомендуют для замены фильтр от Калины. Он дешевле и по качеству исполнения не уступает оригинальному.

Его артикул: 1118-8122010-01.

Где находится фильтр салонный на Лада Гранта Спорт

Замена салонного фильтра Лада Калина 2 поколения

На главную Замена салонного фильтра. Для работы потребуется короткая крестообразная отвертка, шлицевая отвертка и ключ " Torx T ". Для снятия облицовки необходимо извлечь две пробки-заглушки, закрывающие доступ к головкам винтов крепления.

Делаем это при помощи шлицевой отвертки. Ключом Torx отворачиваем 2 винта крепления.

Вместо ключа Torx можно использовать отвертку со сменными битами. Открыв капот, откручиваем еще три винта крепления. Аккуратно снимаем правую облицовку ветрового стекла.

Смотрите также: Ремень ГРМ на гранту 8 клапанов ВАЗ цена

Сделать это можно двумя способами: при открытом капоте потянуть вниз, либо при закрытом капоте и поднятой щетке ветрового стекла, перемещая сначала вправо, а затем вверх. При извлечении не прилагайте больших усилий, чтобы не повредить пластиковых деталей облицовки. Перед открытием капота не забудьте вернуть в исходное состояние щетку ветрового стекла.

Рекомендуем: Литые диски на Лада Веста в Нижнем Новгороде

Крестообразной отверткой отворачиваем винт крепления трубки омывателя и два винта крепления крышки, под которой находится фильтрующий элемент. Извлекаем крышку, перемещая ее сначала вправо, выводя из зацепления, а затем потянув вверх.

Проем, через который происходит снятие крышки, имеет острые края.

ВИДЕО: Замена топливного фильтра на Ладе Калине и Гранте

Берегите руки, работайте в перчатках. При снятой крышке старый фильтр, который отработал всего полгода, имеет плачевный вид Раздвинув в стороны защелки, вынимаем фильтрующий элемент.

На освободившееся место устанавливаем новый фильтр.

В нашем случае фильтрующий элемент должен быть установлен таким образом, чтобы стрелка была направлена. Защелки должны зафиксировать фильтр в месте его крепления. Сборку и установку деталей проводим в обратной последовательности.

E-mail : avto-pozitiv mail. На главную. Замена салонного фильтра. Другие статьи.

Материал по теме: Когда нужно менять масло в коробке автомат на Гранте

Инструкция по замене салонного фильтра на автомобиле Калина (Kalina)

Часто владельцы калины жалуются на плохую вентиляцию печки в связи с чем запотевают окна или просто появляется неприятный запах во влажную погоду (не учитывать кондиционер). Из-за того что фильтр забивается через него начинает меньше поступать свежего воздуха, а так же застрявшая органика может создавать дополнительный неприятный запах.

Я на своей машине стараюсь менять фильтр каждые 6 месяцев, предпочитая такие сезоны как конец осени и начало лета.

Салонный фильтр на калине расположен в передней правой части автомобиля, между подкопотным пространством и лобовым стеклом.

Первым делом открываем капот. Нам нужно открутить пять саморезов, 2 из которых находятся под заглушками.

Заглушки можно подцепить чем нибудь острым и выдавить наружу.

Под ними будут такие же саморезы со звездочкой.

После того как мы открутили все саморезы, нужно защелки защитной решетки вывести из крыла. Я нажимаю на саму решетку и аккуратно сдвигаю ее вправо.

После этого аккуратно, чтобы не повредить капот, выводим защитную решетку в сторону капота.

Перед нами открывается защитный кожух печки, где вставлен фильтр. Он держится на двух саморезах и к нему прикручена трубка идущая от бочка омывайки. Откручиваем все три самореза.

Сначала сдвигаем защитный кожух вправо, а потом под углом вынимаем его на себя.

И нам открывается вид грязного салонного фильтра. Аккуратно вынимаем его отжав защелки по краям. Вынимать нужно очень аккуратно что мусор не попал в печку. Можно заранее убрать лишний мусор который плохо лежит.

Нам открывается вид на мотор печки.

После этого берем новый фильтр. Я беру всегда фильтры с пластмассовым контуром и дополнительным уплотнением. Так больше шансов что в печку ничего не попадет.

Устанавливаем новый салонный фильтр на его законное место, проверяем что все защелки его зафиксировали и на кочках он не вылетит.

Собираем все в обратной последовательности.

 

когда требуется, как выбрать расходник, последовательность работ

Салонный фильтр – неотъемлемый элемент комплектации большинства автомобилей. Он необходим для очистки воздуха, поступающего в салон снаружи. Если своевременно не осуществить его замену, в поездках вам придется дышать грязным воздухом. Кроме того, возможно ухудшение работы печки и кондиционера. Рекомендуется замена стандартного салонного фильтра Лада Гранта примерно через 10–15 тысяч км пробега. Однако длительная эксплуатация машины в местах с сильной загазованностью или на пыльных дорогах может потребовать более частой замены агрегата.


Вернуться к оглавлению

Устройство и назначение агрегата

Оснащать серийные авто для фильтрации воздуха в салоне начали примерно с 91 года. Изначально их основным элементом была фильтровальная бумага, которая могла улавливать частицы не менее 5 мкм, а вот против токсичных газов была практически бессильна. В середине девяностых европейские автомобили стали массово укомплектовываться салонными фильтрами. В более продвинутых фильтрующих элементах теперь уже применялся активированный уголь, служащий для поглощения молекул нежелательных газообразных соединений. Сегодня системой салонной фильтрации оснащено абсолютное большинство машин любых марок.

Зона интенсивного автомобильного движения с плотным и медленным транспортным потоком характеризуется повышенной концентрацией токсичных соединений. В таких условиях воздухозаборник почти впритык примыкает к выхлопной трубе движущегося впереди транспортного средства. Превышение неблагоприятных для здоровья веществ может быть здесь десятикратным. Фильтрация загрязненного токсинами воздуха – одна из ключевых функций салонного фильтра. Кроме того, он препятствует попаданию внутрь частиц сажи, пыли и резины, защищая легкие вредного воздействия, а приборную панель и прочие элементы – от загрязнения.

В настоящий момент на рынке представлены два основных вида салонных фильтров.

  1. Простые противопылевые.
  2. Продвинутые угольные.

Обычные фильтрующие элементы производятся из гофрированной бумаги или синтетического волокна и улавливают пыль, сажу и крупную пыльцу. Против мелкофракционных загрязнений они менее эффективны. Синтетический материал может быть наэлектризован, за счет чего происходит не только механическое удержание частиц, но и их притягивание. Дополнительно обработанный хлором расходник также обеспечивает защиту от бактерий.

Устройство синтетического салонного фильтра

Угольные являются усовершенствованным и, соответственно, более дорогостоящим аналогом простых салонных фильтров. Кроме волокон, здесь применяется активированный уголь, выполняющий функцию абсорбента. Это позволяет более эффективно фильтровать воздух, очищая его от большинства вредных веществ. Как правило, они отличаются многослойной структурой, где угольные элементы перемежаются бумагой или синтетикой. Каждый из таких слоев отвечает за фильтрацию тех или иных типов и размеров.

В угольных фильтрах даже сильно загрязненный воздух подвергается многоэтапной очистке и поступает внутрь уже в пригодном для дыхания состоянии.

Принцип работы угольного фильтра


Вернуться к оглавлению

Когда нужно менять устройство

Производитель обычно указывает рекомендуемую периодичность замены фильтров. У LADA Granta это примерно 15 тысяч километров пробега для салонного фильтра (замену воздушного фильтра двигателя Лады Гранта рекомендуют делать реже – через 30 тыс. ). Но если машина эксплуатируется в условиях повышенного загрязнения атмосферы пылью или газом, имеет смысл производить процедуру чаще – через 10 тысяч километров. Например, фильтрующий элемент скорее придет в негодность при постоянной езде по пыльным грунтовым дорогам или в городе с интенсивным трафиком и крупными предприятиями. Также на долговечность фильтра влияет его качество, уровень которого, соответственно, отражается на стоимости.

Основные признаки того, что требуется замена:

  • недостаточный приток воздуха в салон;
  • отсутствие свежести;
  • неприятный запах;
  • плохое кондиционирование летом;
  • неудовлетворительный подогрев в зимнее время;
  • запотевающие стекла.

В результате своевременной замены фильтра воздух в салоне станет более чистым и приятным, улучшится работа печки зимой и кондиционера летом. Критическое же загрязнение фильтрующих элементов, кроме всего прочего, приводит к тому, что скапливающаяся в них грязь вместе с влагой создает подходящие условия для развития бактерий, успешно размножающихся в вентиляционной системе. Возможны и негативные последствия технического свойства. Например, в авто с климат-контролем отсутствие нормальной фильтрации может привести к нарушению функционирования воздушной системы и обмерзанию радиатора-испарителя.

Некоторые автовладельцы в целях экономии имеют обыкновение не менять испорченный фильтр на новый, а просто его чистить. Затея это мало конструктивная и даже вредная, поскольку собственноручная очистка не может восстановить нормальные свойства фильтрующих элементов. Особенно это касается фильтров угольного типа, работа которых сопряжена с достаточно сложными молекулярными процессами.

Целесообразнее приобретение другого экземпляра. Тем более что в массе своей они не такие уж дорогие. При этом стоит помнить, что цена зависит в основном от того, из каких материалов изготовлено изделие и его качества. Простой пылевой фильтр улавливает в основном пыль, тогда как угольный – не только ее, но и газы.

Если точно марка изделия вам неизвестна, спросите в магазине салонный фильтр для Лады Гранта. Также подойдет и аналогичный для Калины, поскольку они взаимозаменяемы. Можно купить фильтрующую часть без пластикового корпуса, использовав старый и немного сэкономив на этом.


Вернуться к оглавлению

Расположение и правильная замена

Поменять салонный фильтр LADA Granta по силам любому автомобилисту собственными руками, без обращения в сервис. Операция эта довольно несложна и требует минимального количества времени. Для ее осуществления вам будет нужен новый агрегат и две отвертки: крестовая и TORX Т20.

 

Салонный фильтр (он же фильтр системы вентиляции) находится под правой пластиковой накладкой под ветровым стеклом у всех типов Лада Гранта, будь то седан или лифтбек, комплектация 8 клапанов или же 16 клапанов. Если автомобиль только что был на ходу, для начала следует открыть капот и подождать, пока горячий двигатель остынет. Затем поднять дворники в вертикальное положение, при помощи отвертки (или ключа) TORX Т20 открутить и снять накладку.

Далее посредством крестовой отвертки откручиваем пластиковый кожух. Снимаем его, открывая доступ к требующему замены испорченному фильтру.

Теперь аккуратно, стараясь ничего не поломать, производим снятие старого фильтра и заменяем его на новый.

Собственно фильтрующий элемент содержится в прямоугольном пластиковом корпусе (рамке). Если только что купленное устройство у вас без корпуса, удаляем прежнее из рамки, ставим туда новое и помещаем на место.

Салонный фильтр – обязательный элемент для поддержания благоприятной атмосферы внутри авто. Он требует своевременной замены, исходя из его состояния, а не из ориентировочных рекомендаций изготовителя или знатоков в интернете. Выбирая фильтр, лучше обратить внимание на более дорогие изделия авторитетных брендов. Погоня за низкой ценой в данном случае – это экономия на своем здоровье.

Замена салонного фильтра лада гранта

Как сделать замену салонного фильтра на Ладе Гранта

Салонный фильтр отечественный АвтоВАЗ предпочел расположить таким образом, чтобы его можно было просто заменить на новый. Снятие и монтаж не требует особых навыков и инструментов. Располагается деталь в подкапотном пространстве. Какие инструменты требуется подготовить для работы:
  • ключ Torx Т20;
  • крестовая отвертка;
  • новая деталь.

Перед началом работы необходимо изучить подробное руководство, которое позволит завершить смену забитого фильтра на новый быстро и качественно.

Замена салонного фильтра Лады Гранта с кондиционером и без: инструкция

Для начала поднимите дворники в вертикальное положение для того, чтобы обеспечить беспрепятственное снятие части элементов экстерьера Лады Гранта. Пытаться поднять дворники механически нет необходимости. Включите зажигание, активируйте работу очистителей стекла и ждите, пока, они не перейдут в положение, вертикальное капоту, выключите зажигание. Затем снимается часть декоративного фартука, которая располагается у ветрового стекла.

Процесс установки нового фильтра включает следующие шаги:

  1. В вертикальное положение переводятся дворники. Возьмите ключ-звездочку и открутите 5 болтов, фиксирующих ту часть фартука, которая располагается у лобового стекла. Уберите накладку.
  2. Снимается пластиковая насадка у правого дворника. Открывается доступ к кожуху фильтра, отвинчивается два самореза, которые фиксируют крышку. Уберите крышку. Данный элемент вызывает проблемы в установке. При возврате на место могут возникнуть проблемы, поэтому важно запомнить момент снятия, чтобы впоследствии начинать заводить крышку с нужной стороны.
  3. Извлеките кожух салонного фильтра. Так открывается доступ к самому очистителю воздуха. Пластиковый корпус имеет специальные застежки, которые фиксируют деталь. Корпус внутри может оказаться сильно загрязненный, в том числе мелким мусором. Перед началом монтажа необходимо тщательно пропылесосить и протереть корпус слегка влажной тряпкой.
  4. На место старого фильтра ставится новый. Если вы приобрели деталь на рамке, то она просто ставится в корпус. Если приобретен только материал, то не стоит выкидывать рамку от старой детали.

Далее производим постановку на место всех элементов корпуса.

Этапы сборки корпуса:

  1. Защелкиваются два крепления.
  2. Кожух фиксируется двумя саморезами.
  3. Пластиковая накладка на 5 винтах.
Часто при покупке машины Лада Гранта в автомобильном салоне в минимальной комплектации автовладельцу приходится ставить фильтра самостоятельно. Такие модели оснащены местном под расходник, но саму делать придется приобретать самостоятельно.

Выход в данной ситуации простой – поставить очиститель воздуха самостоятельно, используя вышеприведенную инструкцию. Наличие системы кондиционирования не влияет на установку фильтра. При забитом элементе можно получить ухудшение работы кондиционера.

В эксплуатационных документах рекомендуется менять салонный фильтр на каждые 30 тыс. км. В реальности цифра сокращена вдвое – до 15 тыс. км. Или можно ориентироваться на времена года – конец весны или осени.

На Ладу Гранта впору приобрести угольный или обычный фильтр. Они характеризуются следующими параметрами:

  1. Угольный. Задерживает даже запахи. Быстро теряет свои свойства, придется менять чаще обычного. Рекомендуется для местности, которая отличается загрязненным и загазованным воздухом. Стоит относительно дороже других материалов.
  2. Обычный. Является барьером для мелких частиц и мусора. Производитель гарантирует 30 км эксплуатации. Рекомендуется ставить на машину, которая чаще находится в небольшом городе с неплотным движением, в местности, где немного пыли и пробок. Низкая стоимость.

Какой материал выбрать, решать автовладельцу самостоятельно. Но даже угольный салонный фильтр для Лады Гранта стоит не так дорого. Также можно ставить самый дешевый вариант, но менять его чаще.

  1. Процедуру установки салонный фильтр в Ладе Гранта можно самостоятельно. Замена займет не более 20 минут.
  2. Провести замену можно у себя в гараже с минимальным набором инструментов.
  3. Не стоит забывать о регулярности замены.
  4. Если необходимо защищать салон от запахов, то рекомендуется поставить угольный.

Меняем салонный фильтр Лада Гранта своими руками

Фильтр салона на Лада Гранта относится к системе отопления и вентиляции в автомобиле. Сейчас же мы поговорим об особенностях замены данного фильтра, уделив дополнительное внимание комплектации с кондиционером. По сути, процедура не слишком отличается от той, которая проводится на Лада Приора с кондиционером.

Процесс замены салонного фильтра

  1. Чтобы начать работу, открутите крестовой отверткой пять винтов с декоративной крышки под капотом. Они располагаются между моторным отсеком и лобовым стеклом. Извлеките декоративную крышку. Подробнее о местонахождении фильтра мы уже писали в ответе на вопрос пользователя.

Болты обозначены стрелочками (T20)

1 болт защитной крышки

2 болт защитной крышки

Отогните правую защёлку и потяните на себя

Чистим посадочное место

Новый салонный фильтр поролоном вниз

Во время установки нового фильтра, его может потребоваться согнуть, что делается легко, или же с небольшим усилием, в зависимости от конкретной модели фильтра. Важно помнить и о том, какой стороной фильтр должен быть установлен.

Убедиться в правильности установки можно по боковой пометке, представляющей собой надпись со стрелкой.

Когда необходимо производить замену салонного фильтра

Многие люди не знают, когда же нужно проводить замену салонного фильтра, да вообще, нужно ли это делать.

По внешнему состоянию этого фильтра, сразу понятно, почему воздух в салоне «грязный»

Как правило, производитель рекомендует проводить указанную процедуру каждые 30 000 км.

Но касается это «тепличных» условий, когда автомобиль не подвергается активному воздействию пылевого загрязнения. На практике же, проводить замену может потребоваться даже каждые пять тысяч километров, если автомобиль эксплуатируется в условиях грунтовых дорог.

Для владельцев автомобилей с кондиционером важным вопросом будет и то, какой воздух поступает в салон, достаточно ли он чистый и правильной ли он температуры. На это влияет фильтр системы отопления, который может потребоваться заменить.

Выводы

Замена фильтра салона не является проблемой даже для начинающего автолюбителя.

Вам нужно лишь вооружиться крестовой отвёрткой и десятью минутами свободного времени. Уделяйте внимание лишь установке фильтра на место. Тут может потребоваться определённая ловкость. Как мы уже сказали, помочь справиться с задачей поможет отодвигание уплотнительной резины капота, а также шланга вакуумного усилителя.

  • Новый салонный фильтр для вашего автомобиля доступен под индексом 1118-8122010-01.
  • Его можно заменить фильтром от «собрата» в виде Лада Калина, представленного каталожным номером 11180-8122010-82.
  • Некоторые автолюбители рекомендуют устанавливать альтернативный вариант Corteco 80000999, который является фильтром на угольной основе. Его установка особенно актуальна, если автомобиль эксплуатируется в городских условиях.

Машина продолжительное время стоит на открытой стоянке. Постоянно внутри появлялись летом муравьи. Перед установкой салонного фильтра нанес на него специальный гель от насекомых. он без запаха, требуется немного., теперь по салону никто не ползает.

Ого… Хорошо, что я фильтры меняю на сто. Теперь и подавно туда заглядывать не буду! У меня тоже машина под подъездом и днюет и ночует, но муравьев слава богу пока не было! Либо мне на сто тоже такой гель нанесли!

Расположение и удобство замены так себе… Конечно не Mazda или Ford, где нужно откручивать педаль газа, но и, скажем прямо, не Акцент, где достаточно вынуть бардачок, без всяких отверток и прочих инструментов…

На акценте тоже надо изгольнутся руки еле просунешь

Лучше всего использовать угольный фильтр, потому что он лучше фильтрует воздух. Все это можно сделать дома своими руками.

Цена на замену фильтра в салоне совсем не порадовала, решила сама сделать (да, я совсем не разбираюсь в машинах). Благодаря этой статье все прошло куда быстрее и менее проблематично.

при замене фильтра обнаружен, что старый другой — в пластиковом кожухе, а новый просто мягкий и при вставке поролоном вниз не защелкивается а болтается

Старый фильтр вытаскивается из пластиковой рамки, а новый вставляется в неё и вместе с ней защелкивается на место

А угольный фильтр какой стороной устанавливать угольной вверх или вниз?

Салонный фильтр Лада Гранта: замена, уход

Салонный фильтр относится к системе отопления и вентиляции в автомобиле. Речь пойдет о его замене для Лады Гранта, которая идет в комплектации с кондиционером. Для тех, кто уже успел освоить подобную операцию на Приоре (с кондиционером), эта установка покажется знакомой.

Установка фильтра на Ладу Гранту с кондиционером

Многих волнуют вопросы о том, как часто рекомендуется производить замену салонного фильтра и зачем она нужна. Каждые 30 000 км завод-изготовитель рекомендует производить его замену. Но на практике это необходимо делать через 5-7 тыс. км, так как его загрязнение напрямую зависит от того, по каким дорогам вы ездите. Сигналом к этому могут стать плохо работающая печка или грязный воздух, непонятно откуда попавший в салон.

Если вы являетесь счастливым обладателем автомобиля с кондиционером, то вас должен интересовать не только вопрос о дате последней замены фреона. Важно и то, какой воздух подается в салон автомобиля, какой температуры и чистоты. На эти 2 параметра как раз и влияет фильтр системы отопления и вентиляции. Его замена — важный элемент в обслуживании любимого авто. Вспомните, как давно был установлен ваш. Как производится замена салонного фильтра Лада Гранта? Всю процедуру можно поделить на такие основные этапы:

После того как открыт капот, необходимо крестовой отверткой открутить 2 винта. Они находятся на утеплителе кузова. Сам фильтр располагается за двигателем и крепится в вертикальном положении. Чтобы облегчить доступ, можно заранее отодвинуть уплотнительную резинку и отвести шланг вакуумного усилителя. Он особенно мешает при обратной установке.

Если отодвинуть шумопоглощающий материал, станет доступна пластмассовая крышка элемента. Она имеет защелку, после открытия которой крышка снимается. А сам фильтр вытягивается за язычок из пазов. При установке на штатное место потребуется его согнуть. В зависимости от вида фильтра он может сгибаться легко либо с усилием. Важно, какой стороной ставить фильтр. Поэтому на его боковой части стоит соответствующая пометка — надпись со стрелкой.

Замена салонного фильтра Лада Гранта не покажется сложной. Вооружившись крестовой отверткой, можно всю работу выполнить за 10 минут. Отдельное внимание нужно уделить установке устройства на свое место. Здесь нужно проявить некоторую сноровку. На этом этапе помогут меры по обеспечению легкого доступа: отвод шланга вакуумного усилителя, а также отодвигание уплотнительной резинки капота.

Своевременная установка нового салонного фильтра — важный элемент в процессе ухода за автомобилем. Выполнять ее рекомендуется не реже 1 раза в полгода, так как от этого будет зависеть чистота салона и комфорт поездки на автомобиле.

Рейтинг статьи:

Загрузка...

Поделиться в соцсетях:


Замена салонного фильтра на калине

Добро пожаловать!
Салонный фильтр – само название говорит уже за себя, а именно фильтр салона, благодаря нему весь попадаемый воздух который летит при езде в автомобиль, очищается от пыли, от листвы и ненужного рода грязи, но со временем фильтр загрязняется и становится очень грязным, в связи с этим в салон уже летит не очищенный воздух а вся пыль которая скопилась на данном фильтре за всё время, из-за этого ехать становится очень неприятно и постоянно постигают мысли о замене данного фильтра на новый.

Примечание!
Фильтр меняется легко и из инструментов вам будет нужно взять лишь: Набор из нескольких отвёрток и если будет возможность, то пылесос ещё возьмите и обязательно тряпку, пылесос очень удобно всю грязь собирать из того места где был установлен фильтр, в связи с этим при включении печки, она уже не попадёт в салон вашего автомобиля!

Краткое содержание:

Где находится салонный фильтр?
Чтобы к нему подобраться, снять правую облицовку (По ходу движения автомобиля) нужно будет, чтобы её снять поднять щётку которая очищается стекло придётся, после чего плоской отвёрткой или же ножом (Ножом не советуем, потому что пластик мягкий и ко всему этому чёрный и поэтому если вы не аккуратно проделаете работу, то в лучшем случае его поцарапаете, а в худшем проткнёте) подденьте две заглушки которые указаны синими стрелками, после поддевания выньте их и выверните два винта которые за этими заглушками располагались, ко всему этому откройте капот и ещё разыщите два винта (Всего их четыре) которые правую облицовку крепят и следом чуть приподняв её (см. маленькое фото), снимите её полностью с автомобиля, за данной облицовкой будет расположен защитный кожух (Вы его сразу же увидите) сняв который, вы обеспечите для себя доступ к салонному фильтру в автомобиле, более подробно как его снять вы узнаете по мере прочтения данной статьи.

Когда нужно менять салонный фильтр?
Всё от вас зависит, если воздух в автомобили перестал быть свежим (Стал пыльным, дышать стало тяжело и т.д.) то можно уже подумать о замене данного фильтра на новый, но вообще люди рекомендуют производить его замену раз в 15.000 тыс. км., но при этом, нужно ещё учитывать тот факт по каким дорогам эксплуатируется машина, если по пыльным или просто в мегаполисе где окружающий воздух загрязнён, то данный фильтр подлежит замене гораздо чаще (К примеру раз в 10.000 тыс. км.), кроме этого нужно учитывать ещё тот факт, что печка при работе с салонным фильтром связана (Она то только с ним и связана, больше не для чего фильтр и не нужен) и если вы захотели включить печку, то весь воздух будет проходить через этот фильтр и если он загрязнён, он в салон будет попадать, ну и кроме этого всего, ещё и печка станет хуже работать (Ей тяжелее будет, потому что воздух через засорённый фильтр на много будет неохотней проходить).

Примечание!
Любые фильтрующие элементы преследуют одну цель, не дать пройти мусору и пыли через то место где они установлены, но при этом при всём они ещё и забирают в себя всю эту грязь и пыль, и со временем (Когда фильтр переполнен грязью) у него происходит выброс всей грязи, такой процесс называется десорбцией (Он только происходит у угольных фильтрах, салонные фильтра кстати все в основном и идут угольными) в связи с этим процессом, большую часть пыли и грязи он выкидывает в салон автомобиля, поэтому не жалейте денег на данную вещь и меняйте её как можно чаще, потому что кроме пыли он вбирает в себя ещё ядовитые выбросы из выхлопных систем проезжающих автомобилей, которые в последствии тоже отправляются в салон автомобиля, если не производить замену фильтра на новый!

Как заменить салонный фильтр на ВАЗ 1117-ВАЗ 1119?

Снятие:
1) Сложного в этом ничего нет и за минут 5-10 с поставленной задачей вы справитесь, сперва (Об этом кстати говорилось выше) нужно снять правую облицовку и после её снятия вы для себя обеспечите доступ к защитному кожуху под которым находится фильтр, данный кожух крепится на трёх винтах (Все винты на фотографии ниже указаны), при этом один из винтов ещё и держит шланг идущий от омывателя лобового стекла, так вот когда винты будут выкручены, приступайте к снятию самого защитного кожуха с машины, для этого в начале чуть приподнимите рукой край у кожуха (Тот край который ближе к крылу находится) и попытайтесь переместить кожух в сторону другого крыла (Левого получается, по ходу движения автомобиля смотреть нужно) и после чего снимайте его аккуратно с автомобиля.

2) Когда кожух будет снят, приступайте к снятию салонного фильтра с автомобиля, чтобы эту операцию провести, будет нужно боковые защёлки (Указаны стрелками) чуть-чуть отогнуть и только после чего вынимать фильтр из того места где он установлен, во время вынимания старайтесь его не переворачивать и особо не трясти, потому что он загрязнён и если вы его перевернёте, то вся грязь упадёт в систему отопления (В печку) для наглядности на маленьком фото показана картинка, которую вы увидите после снятия фильтра, в центральной части расположена деталь которая относится к той самой системе отопления и поэтому старайтесь чтобы именно туда грязь и не попала.

Примечание!
Если у вас есть тряпочка или пылесос, то в этом случае вокруг того места где был установлен фильтр, уберите всю грязь и листву, при этом как мы уже выше сказали, старайтесь чтобы она не попадала во внутрь системы отопления, а то если пыль к примеру попадаёт, то некоторое время в салоне она будет находится (Пока не выветрится), а если листва, то она может забить систему отопления и в связи с этим печка будет плохо работать!

Установка:
Новый фильтр и все остальные детали устанавливаются в обратном порядке снятию, но только при установке нужно учитывать кой какой факт, а именно уплотнительная полоса которая идёт по центру (Она есть только лишь на одной стороне), обязательно должна всегда находится снизу при установке, а сверху когда фильтр будет установлен кроме его гофр ничего быть не должно, более подробно увидеть эту полосу вы можете на фотографии ниже.

Дополнительный видео-ролик:
Ниже закреплён видео-ролик, просмотрите его и вы наглядно увидите для себя как производится замена салонного фильтра на автомобилях Лада Калина, только в том ролике в конце фильтр был установлен не верно (Полоской вверх), вы же когда всю операцию производить будете, следите за тем чтобы полоска в нижней части находилась.

Салонный фильтр Лада Гранта, замена фильтра своими руками. Салонный фильтр Лада Гранта. Снятие и замена салонного фильтра Гранта из того, что подходит

Салонный фильтр Относится к системе отопления и вентиляции в автомобиле. Речь пойдет о его замене, идущей в комплектации с кондиционером. Тем, кто уже успел освоить такую ​​операцию на приоре (с кондиционером), эта установка покажется знакомой.

Установка фильтра на Лада Грант с кондиционером

Многих волнует, как часто рекомендуется салонный фильтр и зачем он нужен.Каждые 30 000 км производитель рекомендует его заменять. Но на практике это необходимо делать за 5-7 тысяч км, так как его загрязнение напрямую зависит от того, по каким дорогам вы ездите. Сигналом к ​​этому может быть плохо работающая печка или грязный воздух, непонятно куда в салон.

Если вы счастливый обладатель автомобиля с кондиционером, вас должен интересовать не только вопрос о дате последней замены фреона. Важно и какой воздух подается в салон автомобиля, какой температуры и чистоты.На эти 2 параметра как раз влияет система отопления и вентиляции. Его замена - важный элемент в обслуживании любимой машины. Вспомните, как ваш уже давно установлен. Как проходит замена салонного фильтра Лады Грант? Всю процедуру можно разделить на такие основные этапы:

  • подготовка к работе;
  • доступ;
  • замена на новый.

После того, как капот открыт, нужно выкрутить 2 винта крестовой отверткой. Они находятся на утеплителе корпуса.Сам фильтр находится за двигателем и крепится в вертикальном положении. Для облегчения доступа можно заранее сдвинуть уплотнительную резинку и взять шланг вакуумного усилителя. Особенно мешает обратная установка.

При перемещении будет доступна пластиковая крышка элемента. Имеет защелку, после открытия которой крышка снимается. А сам фильтр вытаскивается за язычок из пазов. Надо будет отогнуть до штатного места.В зависимости от типа фильтра он может легко сгибаться с усилием. Важно, с какой стороны ставить фильтр. Поэтому на его боковой части есть соответствующая отметка - надпись со стрелкой.

Замена салонного фильтра Лада Грант не кажется сложной. Вооружившись крестовой отверткой, вы сможете выполнить всю работу за 10 минут. Отдельное внимание стоит уделить установке устройства на свое место. Здесь нужно проявить некоторую сноровку. На этом этапе помогут меры по обеспечению беспрепятственного доступа: шланг вакуумного усилителя, а также убогая уплотнительная резинка.

Так устроено, что салонный фильтр на Лада Грант полностью идентичен очистным элементам от Нивы (4х4), Лады Калины. По сути, это и есть тот самый фильтр. Производитель не стал изобретать ничего нового в производстве грантовой модели. Так что при покупке смело выбирайте один из вариантов, любой.

Очиститель воздуха проще заменить сам, т. К. Операция не такая сложная. Чтобы обратиться в сервис, нужно время и деньги. Чего часто не хватает.

Несмотря на безопасность периметра из пластика, элемент воздушной системы очень подвержен воздействию влаги, брызг.Нередки случаи преждевременного износа, деформации из-за влаги. В целях максимальной защиты, увеличения срока использования автомобилисты практиковали носить чулочный фильтр. Он служит дополнительным очистителем на пути воздушного потока. Насколько качественно и приемлемо, решать каждому индивидуально.

Как часто менять?

В инструкции по эксплуатации указан интервал 30 000 км. Запустить. На практике мало кто из автомобилистов придерживается рекомендаций, старайтесь обновить очиститель за 5 - 7 тысяч ранее установленных сроков.При условии работы машины в особых климатических зонах с повышенной запыленностью ресурс газового фильтра снижается на треть.

При необходимости замены очистителя салона:

    автомобилист
  • STR указал на наступление;
  • капитальный ремонт автомобиля;
  • восстановление после аварии, столкновения, удара;
  • попадание воды после длинных рулей;
  • плановый технический осмотр В мастерской;
  • в салоне хейры неприятный запах, гниль, прелести;
  • уменьшилась мощность воздушного потока от дефлекторов, обдува нет.

Выбор салонного фильтра на гранту

Параметры заводского фильтрующего элемента: прямоугольная форма, 16,1 х ​​25,6 х 3,55 см. Наполнитель изготовлен из специальной бумаги, уложенной в несколько слоев. По внешнему периметру пластиковый корпус одновременно служит краем жесткости, чтобы избежать деформации изделия. В некоторых моделях есть алюминиевая вставка по центру, но цена такого изделия несколько дороже стоковых аналогов.

Заводской каталог Товаров:

  • «Фильтр Сервис», АРТ.11180-8122010-00 (11180-8122010-01, 11180-8122010-03, 11180-8122010-08), стоимость 350 руб .;
  • 1118-8122010-82, от 400 руб .;
  • салонный Lada Grant Filter с добавкой поглотителя (угольный), 1118-8122010-00 (ВФ-018Н), от 350 руб .;
  • 11180-8122010-08 - аналог по цене 250 рублей;
  • Фильтр Кнехта, Ла 933, от 1200 руб.

Приобретать расходные материалы Заводского производства лучше в официальных точках продаж, у дилеров, других офисах.В последнее время место заказа становится наиболее популярным с последующей установкой запчастей в сертифицированных мастерских. Объясняется это следующими факторами: невысокая стоимость по сравнению с альтернативными вариантами, гарантия качества, профессиональный монтаж, послегарантийное обслуживание.

Замена салонного фильтра Лада Грант

Поменять салонный фильтр на Лада Гранта не так уж и сложно, при соблюдении рекомендаций. Не более 15 минут по времени.

Подготовительный этап: Новое чистящее средство строго в соответствии с каталожными товарами, указанными выше, набор автомобильных инструментов, отвертка, тряпка.

Где находится салонный фильтр: расположение нестандартное - под отверстие с правой стороны. По словам автовладельцев, конструкция неудобная, доступ к элементу крайне затруднен. Чтобы самостоятельно провести профилактику, вам потребуется снять два защитных пластиковых чехла.

Последовательность:


В заключение соберите конструкцию пневмосистемы лада ГРАНТА, Запустите силовой агрегат, проверьте работоспособность и герметичность. При наличии притока воздуха, деформации защитного кожуха последний необходимо менять.

Сегодня мы расскажем о том, как поменять салонный фильтр на Лада Грант , где он находится и как к нему добраться. Салонный фильтр на Лада Гранта Рекомендуется менять на каждом плане тогда, однако, если вы массовый, эксплуатируете машину в пыльной местности, то вам придется делать это явно почаще. Просто включите печку на полную мощность И если вы понимаете, делает ли пыль в салоне, при сильном фильтре пыль из воздуховодов явно попадает в салон.В нашем случае воздух салонный фильтр Был в ужасном состоянии:

Для замены воздушного фильтра На гранту нам потребуются крестовая отвертка и отвертка torx t20.

Выворачиваем 5 саморезов типа Т20 (картинки отмечены красным) ...

... и снимаем пластиковую накладку. Учтите, что для удобства снятия рамки дворники лучше перевести в вертикальное положение.


Снимите пластиковый кожух салонного фильтра.

Вытаскиваем фильтр, он вставляется в пластиковую рамку. Дарю фильтр от рамы и вставляю к нему фильтр от калины. Брал самый дешевый, так как думал, что он не подойдет.

Ставим фильтр на место и наслаждаемся кристально чистым воздухом в машине =)


Как видите ничего сложного в процессе замены фильтра на гранту , можно встретить минут 30 с небольшим перекусом.Будем рады видеть Вас в нашем клубе любителей Lada Grant на форуме.

Салонный фильтр является неотъемлемой частью системы вентиляции и отопления. Здесь мы рассмотрим технологию замены этого фильтра в модели Лада Грант, оснащение которой предполагает наличие кондиционера. Эта процедура будет знакома категории владельцев, которые ранее сталкивались с ней в предыдущей модели.

Как заменить фильтр?

Многих задает совершенно обычный вопрос, с какой периодичностью производится замена салонного фильтра и для чего эта процедура? Установку рекомендуется склонять к замене фильтрующего элемента через каждые 30 тыс. Км.Практическая эксплуатация свидетельствует о снижении этого регулятора до 5-7 тыс. Км. Если автомобиль компенсирует загрязненные дороги, то частоту следует корректировать с учетом индивидуальных особенностей эксплуатации. В виде основных сигналов о возникновении необходимости в рассматриваемой процедуре процедура сводится к работе печки или появлению «из ниоткуда» грязного воздуха внутри салонного пространства Лады Грант.

Счастливых владельцев Лада Грант, чья комплектация предусматривает наличие полезной системы кондиционирования, кроме прямой замены фильтра, беспокоят моменты, касающиеся адекватности фреона в контуре, сроки его замены. , температура и степень очистки воздуха, подаваемого в салон.На два последних аспекта влияет фильтрующий элемент.

Важность процесса замены сложно переоценить, так как фильтр «переживает» за здоровье людей, передвигающихся на автомобиле Lada. Это связано с постепенным загрязнением фильтрующего вкладыша, которое со временем становится рассадником вирусов и грибков. Своевременная замена Салонный фильтр предотвращает этот процесс.

Как поменять фильтр в салоне. Процедура разбита на такие последовательные этапы:

  • прямое приготовление;
  • обеспечение доступа к локации;
  • Демонтажные манипуляции с использованным фильтром;
  • установка нового компонента.

Замена

  1. После открытия капота Лада Гранта. Крестообразной отверткой откручиваем два винта, расположенные на поверхности изоляционного материала корпуса.
  2. Фильтр расположен прямо за двигателем. Элемент фиксируется в вертикальном положении.
  3. Для свободы доступа сдвигаем уплотнительную резинку и снимаем насадку вакуумного усилителя (это помеха при настройке фильтра).
  4. После снятия шумоизолирующего материала открывается доступ к пластиковой крышке элемента.Снимается при открытии присутствующей защелки.
  5. Выньте фильтр из паза, потянув за специальный «язычок».
  6. При установке изделия предполагается его небольшое сжатие (для удобства).

Важно! Фильтр устанавливается только в одном положении, так как на соответствующей боковой части нанесенная этикетка сигнализирует в виде надписи с развернутым логотипом.

Итак, теперь вы знаете, как заменить фильтр.

Мощность

Замена салонного фильтра на отечественной Лада Гранта выглядит очень просто.Если использовать отвертку с заданным профилем наконечника, то на всю «операцию» потребуется не более 15 минут временного ресурса. Моментом, требующим небольшой концентрации внимания, станет установка «свежего» фильтра на проектируемое место. Это связано с предоставлением достаточного пространства для доступа.

Своевременно заменяйте салонный фильтр в Лада Гранта, не пренебрегая рекомендацией выполнять эту процедуру хотя бы раз в два раза. Это позволит добиться завидной чистоты воздуха в салоне и исключить появление неприятных сюрпризов в работе такого сложного узла, как система кондиционирования.

Максимально соблюдаемый салонный фильтр современных автомобилей вне зависимости от страны и фирмы производителя. Лада Грант тоже оснащается таким фильтром начиная с базовой комплектации. Этот фильтр необходим для фильтрации воздуха, поступающего в салон автомобиля извне. Если вовремя не заменить его, печка может плохо заработать, воздух, поступающий в салон, не будет очищаться, а водитель и его пассажиры будут дышать мелкими частицами пыли и бактериями, размножающимися на поверхности фильтра.

Производитель рекомендует менять салонный фильтр Лада Грант каждые 5-7 тыс. Км.Однако, если вам часто приходится ездить по пыльным дорогам или пересеченной местности, рекомендую заменить дедлайн раньше указанного срока. Если однажды, включив печку, вы увидели, что из воздуховодов идет пыль или неприятный запах - это сигнал к замене салонного фильтра.

Замена салонного фильтра Лада Грант - Пошаговая инструкция с фото

Для работы понадобятся всего два инструмента:

  1. крестовая отвертка;
  2. отвертка TORX T20;
  3. Новый салонный фильтр гранта или.

Начнем !?

1. В первую очередь необходимо открыть и дать двигателю остыть.

2. Поднимите вертикальное положение.

4. Теперь возьмите крестовую отвертку и открутите два винта, которыми крепится пластиковая крышка салонного фильтра.

5. Снимите кожух, после чего вы увидите салонный фильтр, который вам нужно будет заменить.

6. Отдайте рамку фильтра вместе с самим фильтром и удалите старый фильтр из рамки.

7. Салонный фильтр на гранту не нашел поэтому взял салонный фильтр от Лады Калины. Наденьте на него рамку от старого фильтра и установите следующую услугу.

А так выглядел старый салонный фильтр:

На этом замена салонного фильтра Лада Грант заканчивается. Спасибо за Ваше внимание. Надеюсь, у вас все получилось !? Перед новыми встречами на сайте своими руками.

& nbsp.

Лады салонного фильтра выдают, замена фильтра своими руками.Меняем салонный фильтр Лада Гранта своими руками Где находится салонный фильтр Лада Гранта лифтбэк

В этом обзоре мы расскажем, как сэкономить на поездках к дилеру, и покажем, как легко снять и заменить салонный фильтр на Lada Granta. Рекомендуем менять фильтрующий элемент как можно чаще, т.е. несколько раз в год для более эффективной работы печи, когда в салоне нет запаха и не запотевают окна.Для этого мы приобрели салонный фильтр на Грант у авторитетной компании ТСН, специализирующейся на производстве фильтров. Также для замены нам понадобится стандартный набор ключей, в том числе Torx.

Выбор салонного фильтра на Грант

Артикул / номер ТСН 9.7.25 (фильтр салонный угольный) за 180 руб, также можно поставить:
Sakura CA-25050 за 261 рубль
BIG Filter GB-9831 за 200 руб
Mann CU 26 004 за 580 руб

Советуем взять более дешевый аналог от ТСН, ведь по такой цене можно довольно часто менять салонный фильтр Лада Гранта, при этом качество товара остается на высоком уровне и вы всегда будете дышать чистым воздухом.

Замена салонного фильтра на Лада Гранта

На начальном этапе необходимо будет снять пластиковую вставку для остановки дворников, для этого открутить пять болтов ее крепления

Для снятия и замены салонного фильтра на Лада Грант необходимо с усилием прижать фильтр, чтобы он выпал из крепежной рамки и вставить новый салонный фильтр ТСН.

Видео: как снять и заменить салонный фильтр Лада Гранта своими руками

Плохо работает печка или слабо дует кондиционер? Независимо от марки и модели автомобиля, с этой проблемой может столкнуться каждый.Часто виной всему забит салонный фильтр. Рассмотрим как проходит замена салонного фильтра Гранта. Салон меняется относительно легко и одинаково на Гранте и Калине вне зависимости от того, есть кондиционер или нет. Переход с улицы на моторный отсек - демонтаж сложных элементов не требуется. Бытует мнение, что очиститель воздушного потока на лифтбэке Lada Granta отличается размерами от седана Granta. В соответствии с данными, указанными в инструкции по эксплуатации, фильтрующие элементы взаимозаменяемы между моделями.Отличий нет. Очевидно, что процесс удаления / установки также идентичен.

Интервал замены салонного фильтра Grana

В инструкции по эксплуатации технического устройства указан интервал 30 000 км. пробег. На практике рекомендаций придерживаются немногие автомобилисты, стараясь обновить пылесос на 5-7 тысяч раньше установленного срока. Если машина эксплуатируется в особых климатических зонах с повышенной запыленностью, загазованностью, уменьшите ресурс бумажного фильтра на треть.

Выбор салонного фильтра на Грант

Параметры заводского фильтрующего элемента: прямоугольный, 16,1 х ​​25,6 х 3,55 см. Наполнитель изготовлен из специальной бумаги, уложенной в несколько слоев. По внешнему периметру расположен пластиковый корпус, который также выполняет роль ребра жесткости во избежание деформации изделия. В некоторых моделях есть алюминиевая вставка по центру, но цена такого изделия несколько дороже стоковых аналогов. Есть 2 типа салонных фильтров: угольный и штатный.При выборе учитываем следующие моменты: Товаров заводского каталога: «Фильтр-Сервис», арт. 11180-8122010-00 (11180-8122010-01, 11180-8122010-03, 11180-8122010-08), стоимость от 350 рублей; 1118-8122010-82, от 400 руб .; салонный фильтр Lada Granta с добавкой поглотителя (угольный), 1118-8122010-00 (ВФ-018н), от 350 руб .; 11180-8122010-08 - аналог по цене 250 рублей; Фильтр Кнехта, LA 933, от 1200 руб. Приобретать сборные расходные материалы лучше в официальных точках продаж, у дилеров и других представительствах.В последнее время наиболее популярен способ заказа с последующей установкой запчастей в сертифицированных мастерских. Это можно объяснить следующими факторами: невысокая стоимость по сравнению с альтернативными вариантами, гарантия качества, профессиональный монтаж, послегарантийное обслуживание.

Необходимый инструмент для замены фильтра своими руками

Отвертка крестовая; Ключи TORX на 15, 20; Новый чистящий элемент; Дополнительное оборудование, комплектующие, если вы планируете проводить сторонние работы.

Процесс замены

Замена салонного фильтра в Гранте - вопрос 10-20 минут 1 ... Первый шаг - открыть капот и дать двигателю остыть. 2 ... Поднимите дворники в вертикальное положение. 3 ... Отверткой TORX T20 открутите пластиковую крышку возле лобового стекла.

4 ... Далее берем отвертку Phillips и откручиваем ею два самореза, на которых крепится влагостойкий пластиковый кожух салонного фильтра.

5 ... Снимите крышку.

6 ... Это салонный фильтр, который необходимо заменить.

7 ... Вытаскиваем фильтр вместе с рамкой и вынимаем из него. Установите старую раму на новый, предварительно купленный фильтр.

8 ... Устанавливаем фильтр на машину. Собираем все в обратном порядке.

Видео по замене салонного фильтра Лада Гранта

ЧИТАЙТЕ ТАКЖЕ НА САЙТЕ

Демонтаж радиатора системы охлаждения может потребоваться, если он потерял герметичность или если есть большие повреждения.В этой статье мы подробнее рассмотрим, как продвигается такая работа как на обычном автомобиле, так и на ...

Поперечные трещины на ремне Шевроле Нива, появившиеся как внутри, так и снаружи, указывают на необходимость срочная замена. Производитель рекомендует проводить эту процедуру раз в два года или через каждые 60 тысяч километров пробега. ...

Радиатор печки выполняет важную функцию в системе отопления Шевроле Нива. Если теплообменник неисправен, производительность системы снижается, что не только снижает комфорт автомобиля, но также может вызвать перегрев двигателя....

Бытует мнение, что воздухоочиститель на лифтбэке Лада Гранта отличается размерами от седана Гранта. В соответствии с данными, указанными в инструкции по эксплуатации, фильтрующие элементы взаимозаменяемы между моделями. Отличий нет. Очевидно, что процесс удаления / установки также идентичен.

Салонный фильтр играет важную роль для тела водителя, как воздушный элемент для топливной смеси.Чем чище вдыхаемый поток, тем лучше здоровье, лучше самочувствие, меньше болезнетворных бактерий проникает внутрь.

Процесс замены совсем не сложный, под силу среднестатистическому водителю. Вовсе не обязательно обращаться в сервисный центр. Только в случае крайней необходимости, когда без оперативного вмешательства мастера нет выхода.

Необходимый инструмент для самостоятельной замены

  • отвертка Phillips;
  • Ключи TORX на 15, 20;
  • Новый чистящий элемент;
  • Дополнительное оборудование, комплектующие, если планируется проведение сторонних работ.

Пробег самый оптимальный для работы без чрезмерных загрязнений.
Если Лада Гранта лифтбэк / седан систематически эксплуатируется в условиях повышенной запыленности, то обновите фильтрующий элемент на треть раньше установленного срока.

Где находится салонный фильтр Лада Гранта Лифтбек

Вне зависимости от марки автомобиля расположение салонного фильтра Lada Granta liftback у всех одинаково - под оборкой в ​​правой передней части.

Конечно, выбор не совсем удачный, так как при сильном дожде, лужах вода все же проникает внутрь на бумажное волокно. Это приводит к созданию препятствия на пути воздушного потока, снижению эффективности уборки, проникновению болезнетворных бактерий.

Типичные признаки засорения очистителя салона

  1. недостаточный приток воздуха от дефлекторов;
  2. машина имеет зловонный запах, гниль;
  3. вылетает мусор из дефлекторов;
  4. на центральной консоли приборов есть слой пыли;
  5. не хватает свежего воздуха в салоне после включения вентилятора печки;
  6. водителю, пассажирам постоянно трудно дышать в машине.

Последствия такого воздуха крайне неблагоприятны. Как можно скорее замените фильтр.

Как правильно выбрать салонный фильтр

Самый правильный путь - обратиться за помощью к инструкции по эксплуатации вашего продукта. В разделе расходных материалов смотрите каталожный номер оригинального фильтра.

Конечно, производитель не может указать исчерпывающий список одобренных производителей. Поэтому покупка расходных материалов, не указанных в списке, является личной ответственностью владельца оборудования.

Как вариант, проконсультируйтесь у специалистов автомагазина на предмет совместимости выбранной модели с Lada Granta.

Во избежание покупки подделки мастера мастерской настоятельно рекомендуют приобретать продукцию исключительно в сертифицированных точках, официальных представительствах, дилерских центрах. В меньшей степени пользуйтесь услугами сторонних поставщиков, продающих запчасти по необоснованно низким ценам.


Могут использоваться следующие зарубежные аналоги: KNECHT, NIPPARTS, JAPANPARTS, ASHIKA, MEAT & DORIA, а также ряд других китайских производителей.

Процедура замены салонного фильтра своими руками на Лада Гранта

  1. Устанавливаем машину на ровную площадку, смотровой канал. Использование гидравлического (электрического) подъемника в этом случае не рекомендуется;
  2. выключаем двигатель, открываем капот;
  3. с правой стороны, подходим к оборке, ключом TORX 15 откручиваем четыре болта крепления по периметру;
  4. отложил пластиковую декоративную накладку;
  5. отверткой Phillips откручиваем болт с левой стороны, фиксирующий крышку, под которой находится пылесос;
  6. снимаем старый фильтр, проводим полостной дефект.При сильном загрязнении допускается чистка сухой тканью, использование бытового пылесоса. Правда, с последним нужно быть осторожным, чтобы не затянуть ничего лишнего;
  7. после завершения профилактического обслуживания ставим новый фильтрующий элемент, собираем конструкцию в обратном порядке.

Важно знать !!! При укладке соблюдайте маркировку - направление стрелки на фильтре. Он должен указывать на центрифугу для забора наружного воздуха.В противном случае снабжение кислородом будет несколько затруднено, что нежелательно, так как организм будет испытывать недостаток молекул.

На этом процесс самостоятельной замены салонного фильтра на Лада Гранта лифтбэк закончен.
В заключение отметим, что установить новый салонный фильтр на Лада Гранта совсем не сложно, это под силу каждому водителю. При наличии вышеперечисленных инструментов процесс займет не более 10 минут времени.

Салонный фильтр Лада Гранта - одна из важных деталей, с помощью которой очищается воздушный поток, поступающий в салон автомобиля извне.Важность салонного фильтра очень сложно переоценить, поскольку от него зависит не только чистота в салоне, но и предотвращение попадания в машину разного рода бактерий и запахов.

Как и большинство моделей с передним приводом, Granta имеет салонный фильтр под оборкой на стороне переднего пассажира. На фото ниже показано расположение салонного фильтра:

Сам салонный фильтр прямоугольный. Размеры салонного фильтра Лада Гранта - 160 * 255 * 35 мм.Сам фильтр изготовлен из специальной фильтровальной бумаги, оформлен в пластиковый или картонный футляр. К корпусу приклеивается поролоновый уплотнитель. Некоторые производители могут дополнительно добавлять армирующий клеевой слой в центре фильтра, чтобы предотвратить деформацию фильтра. Фильтр выглядит так:

Фильтр салонный Лада Гранта артикул

Для поиска салонного фильтра на Лада Грант в интернет-магазинах можно воспользоваться следующими статьями:

11180-8122010-00
11180-8122010-01
11180-8122010-03
11180-8122010-08

В Кроме того, возможно использование фильтрующего элемента - 1118-8122010-82.

1118-8122010-00 - салонный фильтр с пластиковой рамкой производства компании «Фильтр-Сервис» (Москва).
Каталожный номер фильтра VF-018n:

Дополнительно есть угольная версия с артикульным номером VF-018u:

Устанавливается на автомобили семейства LADA Kalina и Chevrolet nivabut также подходит Grant.

Фильтр 11180-8122010-08 начали устанавливать на Лада Гранта с 2014 года, что, скорее всего, связано с попыткой удешевить производство автомобилей, так как цена такого фильтра намного ниже, чем у других.Производитель - ЗАО «Мотор-Супер». Фильтр выглядит так:

В конце статьи самое интересное, что беспокоит большинство людей, а именно цена салонного фильтра Lada Granta. Для этого воспользуемся обычным агрегатором запчастей, например Exist.ru. Мы просто заходим в нашу статью и оцениваем ситуацию. Вот что получаем:

Самым дешевым вариантом по запросу артикула № 11180-8122010-00 является BM FA 1118, который стоит 151 рубль, что в принципе не очень дорого по сегодняшним меркам.Но самым дорогим оказался Knecht Filter LA 933, который уже стоит 1180р. средний ценник в районе 250-300 рублей, что в принципе очень высокая сумма для

.

Лучшие салонные фильтры на гранты. Лады салонного фильтра Гранта, замена фильтра своими руками

Плохо работает печка или слабо дует кондиционер? Независимо от марки и модели автомобиля, с этой проблемой может столкнуться каждый. Часто виной всему забит салонный фильтр.Рассмотрим, как заменяется салонный фильтр Гранта.

Как поменять салонный фильтр на Гранте

Хвала АвтоВАЗу - поменять салон сравнительно несложно и то же на Гранте и Калине. Изменения с улицы в подкапотном пространстве - демонтаж сложных элементов не требуется.

Для всех работ потребуется :

  • Ключ Torx Т-20;
  • крестовая отвертка;
  • Новый фильтр.
Все, что требуется для работы: ключ со звездочкой, крестовая отвертка и сменный фильтр.

Пошаговая замена фильтра

Для работы придется снять часть декоративного фартука у основания лобового стекла. Для этого поднимите дворники в вертикальное положение .

Чтобы поднять дворники, включите зажигание и запустите дворники. Как только они достигнут вертикального положения, выключите зажигание. Доступ к фартуку открыт.


Шаг 1: поднимите стеклоочиститель в вертикальное положение.
Шаг 2: демонтировать пластиковую крышку на правом дворнике.

Получил доступ к крышке фильтра - крестовой отверткой откручиваем 2 самореза крышки ... Снимаем.

Запомните порядок снятия крышки. Ставить неудобно - лучше точно знать, с какого края начинать в первую очередь.


Шаг 3: снимите крышку фильтра. Получаем доступ к самому элементу.

Последнее - отогнув защелки крепления, извлеките фильтр ... Если под ним есть листья и мусор, можно пропылесосить или продуть сиденье.

Вы можете купить новый фильтр без монтажной рамки. В этом случае снимите старый фильтр с его рамы и используйте его для установки нового.


Шаг 4: замените старую деталь на новую. Если новый фильтр обрамлен, просто поставьте его на место. В противном случае мы используем рамку из старого элемента.

Сборка в обратном порядке :

  • 2 защелки крепления;
  • 2 самореза в корпусе;
  • 5 винтов в пластиковой крышке.

Особенности замены на Грант стандарт, 8 клапанов без кондиционера

На Гранту номер в стандартной комплектации без фильтра с завода ... Вне зависимости от типа кузова: седан или лифтбэк. Что делать с такими машинами?

Просто установите фильтр согласно нашим инструкциям. Фильтра в машине просто нет - место для него есть и доступ к нему такой же.

Что касается салона, то на кондиционер влияет только одно: после долгой эксплуатации конденсатор начнет сильно дуть.

Видеоинструкция по замене

Общие вопросы по замене: SKU, интервал замены, выбор

Отфильтруйте артикул для поиска и заказа в Интернете: 11180-8122010-03

Как часто менять

Завод регламентирует замену воздушных фильтров каждые 30 000 км.Практика показывает интервал 15000 км от замены до замены. Или дважды в год перед зимой и летом соответственно.

Какой салон выбрать

Есть 2 типа салонных фильтров: угольный и штатный. При выборе учитываем следующие моменты:

Таблица 1. Сравнение салонных фильтров на Лада Грант

Углеродистый Обычный
Как очищает Задерживает запахи Не пропускает мусор и мелкие частицы, запахи проходят через все
Ресурс Считается, что уголь быстро забивается и становится бессмысленным. Как заявлено - до 30 000 км
Где лучше использовать В пыльных условиях, в городе с большим количеством пробок В зоне с чистым воздухом, без пробок и сильной пыли
Стоимость, руб. 250 170

Выбор гранта - дело ваших предпочтений. Стоимость детали остается копейкой, даже если она пропитана углем.Если поставить обычный белый элемент, но регулярно его менять, хуже не станет. Если долго не менять, кто угодно превратится в это фото.

Вместо вывода

Подведем итог:

  • Замена салонного фильтра в Гранте - вопрос 10-20 минут ;
  • Для работ не требуется специального помещения или дорогостоящего инструмента;
  • Необходимо менять элемент каждые 15000км ... либо сезонно перед зимой и летом;
  • Выбор самого фильтра между обычным и угольным - для избавления от запахов лучше взять угольный.

Нужно больше статей для ухода за Грантом? Сделайте ваш выбор.

Ждем комментариев и мнений. Не стесняйтесь писать!

Фильтр салона относится к системе отопления и вентиляции в автомобиле. Речь пойдет о его замене на, который идет в комплекте с кондиционером. Тем, кто уже освоил подобную операцию на Приоре (с кондиционером), эта настройка покажется знакомой.

Установка фильтра на Lada Granta с кондиционером

Многих беспокоит, как часто рекомендуется устанавливать салонный фильтр и зачем он нужен.Производитель рекомендует заменять его каждые 30 000 км. Но на практике это нужно делать через 5-7 тысяч км, так как от того, по каким дорогам вы ездите, напрямую зависит его загрязнение. Сигналом к ​​этому может быть плохо работающая печка или грязный воздух, попавший в салон из ниоткуда.

Если вы являетесь счастливым обладателем автомобиля с кондиционером, то вас должен интересовать не только вопрос о дате последней замены фреона. Также важно, какой воздух подается в машину, какой температуры и чистоты.На эти 2 параметра точно влияет фильтр системы отопления и вентиляции. Его замена - важный элемент в обслуживании любимой машины. Вспомните, как давно был установлен ваш. Как заменяется салонный фильтр Лада Гранта? Всю процедуру можно разделить на следующие основные этапы:

  • подготовка к работе;
  • предоставление доступа;
  • Замена
  • на новый.

После того, как капот будет открыт, нужно отверткой Phillips открутить 2 винта.Они расположены на утеплителе корпуса. Сам фильтр расположен за двигателем и установлен вертикально. Для облегчения доступа можно предварительно сдвинуть уплотнительную резинку и снять шланг вакуумного усилителя. Особенно хлопотно при переустановке.

При откидывании открывается пластиковая крышка элемента. Имеет защелку, после открытия которой крышка снимается. А сам фильтр вытаскивается из пазов за язычок. его нужно будет согнуть на место. В зависимости от типа фильтра он может сгибаться легко или с усилием.Важно, с какой стороны надеть фильтр. Поэтому на его стороне есть соответствующая отметка - надпись со стрелкой.

Замена салонного фильтра Лада Гранта не покажется сложной. Вооружившись отверткой Phillips, вы сможете выполнить работу за 10 минут. Особое внимание стоит уделить установке устройства на свое место. Здесь нужно проявить некоторую сноровку. На этом этапе помогут меры по обеспечению легкого доступа: втягивание шланга вакуумного усилителя, а также отталкивание резинки капота.

Салонный фильтр является неотъемлемой частью системы вентиляции и отопления. Здесь мы рассмотрим технологию замены этого фильтра в модели Lada Granta, оснащение которой предусматривает наличие кондиционера. Эта процедура будет знакома категории владельцев, которые ранее сталкивались с ней в модели Приора.

Как заменить фильтр?

Многие задают довольно частый вопрос, как часто меняют салонный фильтр и зачем нужна эта процедура? Завод рекомендует склоняться к замене фильтрующего элемента через каждые 30 тыс. Км.Практическая эксплуатация свидетельствует о сокращении этого нормативного срока до 5-7 тыс. Км. Если машина пашет по грязным дорогам, то частоту следует регулировать с учетом индивидуальных особенностей эксплуатации. В виде основных сигналов о возникновении необходимости в рассматриваемой нами процедуре, ухудшении работы печки или появлении «ниоткуда» грязного воздуха внутри салонного пространства Lada Granta.

Счастливых владельцев Lada Granta, чья комплектация предусматривает наличие полезной системы кондиционирования, помимо прямой замены фильтра, волнуют вопросы, касающиеся достаточности фреона в контуре, даты его замены. , температура и степень очистки воздуха, подаваемого в салон.На последние два аспекта влияет фильтрующий элемент.

Важность процесса замены трудно переоценить, поскольку фильтр «переживает» за здоровье людей, передвигающихся в автомобиле Lada Granta. Это происходит из-за постепенного загрязнения фильтрующего элемента, который со временем становится рассадником вирусов и грибков. Своевременная замена салонного фильтра предотвращает этот процесс.

Как поменять фильтр в салоне. Процедура разбита на следующие последовательные этапы:

  • прямое приготовление;
  • обеспечение доступа к локации;
  • демонтажные манипуляции с использованным фильтром;
  • установка нового компонента.

Замена

  1. Открыв капот LADA Granta, отверткой Phillips открутите два винта, расположенные на поверхности изоляционного материала кузова.
  2. Фильтр расположен прямо за двигателем. Элемент зафиксирован в вертикальном положении.
  3. Для обеспечения свободы доступа отодвигаем уплотнительную резинку и снимаем трубку вакуумного усилителя (это препятствие при установке фильтра обратно).
  4. После перемещения звукоизоляционного материала обеспечивается доступ к пластиковой крышке элемента. Снимается при открытии присутствующей защелки.
  5. Извлекаем фильтр из пазов, потянув за специальный «язычок».
  6. Предполагается, что при установке элемент будет слегка сжат (для удобства).

Важно! Фильтр устанавливается только в одном положении, которое обозначено на соответствующей боковой части отметкой в ​​виде надписи с логотипом в виде стрелки.

Итак, теперь вы знаете, как заменить фильтр.

Мощность

Замена салонного фильтра на отечественную LADA Granta выглядит очень просто. Если использовать отвертку с заданным профилем наконечника, то на всю «операцию» потребуется не более 15 минут времени. Момент, требующий небольшой концентрации внимания, - установка «свежего» фильтра в намеченном месте. Это необходимо для обеспечения достаточного пространства для доступа.

Своевременно заменяйте салонный фильтр в LADA Granta, не пренебрегая рекомендацией проводить эту процедуру не реже одного раза в полгода. Это позволит добиться завидной чистоты воздушной среды в салоне и исключить появление неприятных сюрпризов в работе такого сложного агрегата, как система кондиционирования.

Так устроено, что салонный фильтр на Лада Гранта полностью идентичен чистящим элементам от Нивы (4х4), Лада Калина.По сути, это тот самый фильтр. Производитель не стал изобретать ничего нового в производстве модели Гранта. Так что при покупке смело выбирайте один из вариантов, подойдет любой.

Самостоятельно заменить очиститель воздуха проще, ведь операция не такая сложная. Чтобы добраться до сервиса, нужны деньги и время. Чего часто не хватает.

Несмотря на то, что он защищен пластиком по периметру, элемент воздушной системы очень чувствителен к влаге и брызгам.Нередки случаи преждевременного износа и деформации из-за попадания влаги. В целях максимальной защиты, увеличения срока использования автомобилисты практикуют надевание на фильтр чулок. Он служит дополнительным очистителем на пути воздушного потока. Насколько это эффективно и приемлемо - решать каждому индивидуально.

Как часто менять?

В инструкции по эксплуатации технического устройства указан интервал 30 000 км. пробег. На практике рекомендаций придерживаются немногие автомобилисты, стараясь обновить пылесос на 5-7 тысяч раньше установленного срока.Если машина эксплуатируется в особых климатических зонах с повышенной запыленностью и загазованностью, уменьшите ресурс бумажного фильтра на треть.

Когда необходимо заменить очиститель кабины:

  • смотритель СТО указал срок;
  • капитальный ремонт автомобиля;
  • восстановление после аварии, столкновения, удара;
  • попадание воды после длительных поездок по лужам;
  • плановый технический осмотр в цехе;
  • в салоне слышен неприятный запах, гниль, прелести;
  • уменьшилась сила потока воздуха от дефлекторов, потока воздуха нет.

Выбор салонного фильтра на Грант

Параметры заводского фильтрующего элемента: прямоугольный, 16,1 х ​​25,6 х 3,55 см. Наполнитель изготовлен из специальной бумаги, уложенной в несколько слоев. По внешнему периметру расположен пластиковый корпус, который одновременно выполняет роль ребра жесткости во избежание деформации изделия. В некоторых моделях есть алюминиевая вставка по центру, но цена такого изделия несколько дороже стоковых аналогов.

Товаров в каталоге фабрики:

  • «Фильтр-Сервис», арт.11180-8122010-00 (11180-8122010-01, 11180-8122010-03, 11180-8122010-08), стоимость от 350 рублей;
  • 1118-8122010-82, от 400 руб .;
  • салонный фильтр Lada Granta с добавкой поглотителя (угольный), 1118-8122010-00 (ВФ-018н), от 350 руб .;
  • 11180-8122010-08 - аналог по цене 250 рублей;
  • Фильтр Кнехта, LA 933, от 1200 руб.

Приобретать сборные расходные материалы лучше в официальных точках продаж, у дилеров и других представительствах.В последнее время наиболее популярным методом является заказ с последующей установкой запчастей в сертифицированных мастерских. Объясняется это следующими факторами: невысокая стоимость по сравнению с альтернативными вариантами, гарантия качества, профессиональный монтаж, послегарантийное обслуживание.

Замена салонного фильтра Лада Гранта

Поменять салонный фильтр на Лада Гранта своими руками не так уж и сложно, при соблюдении рекомендаций. По времени не более 15 минут.

Подготовительный этап: новый очиститель строго в соответствии с каталожными номерами, указанными выше, набор автомобильного инструмента, отвертка, ветошь.

Где находится салонный фильтр: расположение нестандартное - под оборкой с правой стороны. Как отмечают автовладельцы, неудобная конструкция, доступ к элементу крайне затруднен. Чтобы провести профилактику самостоятельно, вам потребуется снять две защитные пластиковые крышки.

Последовательность:


В заключение собираем конструкцию пневмосистемы Лада Гранта, заводим силовой агрегат, проверяем работоспособность и герметичность.Если есть утечка воздуха, деформация защитного кожуха, последний необходимо заменить.

Бытует мнение, что воздухоочиститель на лифтбэке Лада Гранта отличается размерами от седана Гранта. В соответствии с данными, указанными в инструкции по эксплуатации, фильтрующие элементы взаимозаменяемы между моделями. Отличий нет. Очевидно, что процесс удаления / установки также идентичен.

Салонный фильтр играет важную роль для тела водителя как воздушный элемент для топливной смеси.Чем чище вдыхаемый поток, тем лучше здоровье, лучше самочувствие, меньше болезнетворных бактерий проникает внутрь.

Процесс замены совсем не сложный, под силу среднестатистическому водителю. Вовсе не обязательно обращаться в сервисный центр. Только в случае крайней необходимости, когда без оперативного вмешательства мастера нет выхода.

Необходимый инструмент для самостоятельной замены

  • отвертка Phillips;
  • Ключи TORX на 15, 20;
  • Новый чистящий элемент;
  • Дополнительное оборудование, комплектующие, если планируется проведение сторонних работ.

Пробег самый оптимальный для работы без чрезмерных загрязнений.
Если Лада Гранта лифтбэк / седан систематически эксплуатируется в условиях повышенной запыленности, то обновите фильтрующий элемент на треть раньше установленного срока.

Где находится салонный фильтр Лада Гранта Лифтбек

Вне зависимости от модификации марки автомобиля расположение салонного фильтра Lada Granta liftback у всех одинаково - под оборкой в ​​правой передней части.

Конечно, выбор не совсем удачный, так как при сильном дожде, лужах вода все же проникает внутрь на бумажное волокно. Это приводит к созданию препятствия на пути воздушного потока, снижению эффективности очистки, проникновению болезнетворных бактерий.

Типичные признаки засорения очистителя салона

  1. недостаточный приток воздуха от дефлекторов;
  2. в машине зловонный запах, гниль;
  3. вылетает мусор из дефлекторов;
  4. на центральной консоли приборов есть слой пыли;
  5. не хватает свежего воздуха в салоне после включения вентилятора печки;
  6. водителю, пассажирам постоянно трудно дышать в машине.

Последствия такого воздуха крайне неблагоприятны. Как можно скорее замените фильтр.

Как правильно выбрать салонный фильтр

Самый надежный способ - обратиться за помощью к инструкциям по использованию вашего продукта. В разделе расходных материалов ознакомьтесь с каталожным номером оригинального фильтра.

Конечно, производитель не может указать исчерпывающий список одобренных производителей. Поэтому покупка расходных материалов, не указанных в списке, является личной ответственностью владельца оборудования.

Как вариант, проконсультируйтесь у специалистов автомагазина о совместимости выбранной модели с Lada Granta.

Во избежание покупки подделки мастера СТО настоятельно рекомендуют приобретать продукцию исключительно в сертифицированных точках, официальных представительствах, дилерских центрах. В меньшей степени пользуйтесь услугами сторонних поставщиков, продающих запчасти по необоснованно низким ценам.


Могут использоваться следующие зарубежные аналоги: KNECHT, NIPPARTS, JAPANPARTS, ASHIKA, MEAT & DORIA, а также ряд других китайских производителей.

Процедура замены салонного фильтра своими руками на Лада Гранта

  1. Устанавливаем машину на ровную площадку, смотровой канал. Использование гидравлического (электрического) подъемника в этом случае не рекомендуется;
  2. выключаем двигатель, открываем капот;
  3. с правой стороны, подходим к оборке, ключом TORX 15 откручиваем четыре болта крепления по периметру;
  4. отложил пластиковую декоративную накладку;
  5. отверткой Phillips откручиваем болт с левой стороны, фиксирующий крышку, под которой находится пылесос;
  6. снимаем старый фильтр, проводим полостной дефект.При сильном загрязнении допускается чистка сухой тканью, использование бытового пылесоса. Правда, с последним нужно быть осторожным, чтобы не затянуть ничего лишнего;
  7. после завершения профилактического обслуживания ставим новый фильтрующий элемент, собираем конструкцию в обратном порядке.

Важно знать !!! При укладке соблюдайте маркировку - направление стрелки на фильтре. Он должен указывать на центрифугу для забора наружного воздуха.В противном случае снабжение кислородом будет несколько затруднено, что нежелательно, так как организм будет испытывать недостаток молекул.

На этом завершается процесс самостоятельной замены салонного фильтра на Лада Гранта лифтбэк.
В заключение отметим, что установить новый салонный фильтр на Лада Гранта совсем не сложно, это под силу каждому водителю. При наличии вышеперечисленных инструментов процесс займет не более 10 минут времени.

Одновременное считывание нескольких пар FRET с использованием фотохромизма

Введение

Фёрстеровский резонансный перенос энергии (FRET) является мощным механизмом для объединения зондов in situ .Эксперименты FRET выполняются путем маркировки интересующей системы донорными и акцепторными флуорофорами, а затем с использованием степени передачи энергии для определения расстояний между и относительной ориентации обоих флуорофоров [1]. Подходы на основе FRET приобрели огромную популярность для ассоциативных исследований и могут выполняться с использованием как генетически кодируемых флуорофоров, так и органических красителей [2]. Это также ключевой механизм, лежащий в основе класса генетически закодированных биосенсоров, которые преобразуют присутствие определенного химического стимула в изменение FRET [3–6].

В большинстве экспериментов с FRET используются флуоресцентные донор и акцептор, что имеет то преимущество, что эффективность FRET может быть оценена на основе отношения между возбужденным донором излучением обоих флуорофоров [7–10]. Точность этой оценки зависит от легкости, с которой донор и акцептор могут быть спектрально отделены друг от друга. Выбор конкретных пар FRET обычно обусловлен компромиссом между достижением четко наблюдаемой эффективности FRET, которая требует достаточного спектрального перекрытия, и поддержанием низкого уровня перекрестных помех между каналами, что упрощается, когда зонды более спектрально разделены.В результате донор и акцептор имеют тенденцию занимать широкие области видимого спектра, что усложняет комбинацию измерений FRET с использованием других зондов. Измерение нескольких конструкций на основе FRET еще более усложняется, если эти конструкции имеют общие флуорофоры, излучающие в одной и той же спектральной полосе. Например, многие биосенсоры FRET состоят из голубого и желтого флуоресцентных белков, что затрудняет объединение нескольких биосенсоров, например перекрестная связь между сигнальными путями.Использование более чем одного из этих датчиков обычно требует выполнения отдельных измерений для каждого датчика, возможно, с высокой пропускной способностью [11].

Ряд стратегий может облегчить мультиплексирование FRET [12]. Концептуально самый простой подход - выбрать две или более пар FRET с минимальным спектральным перекрытием, хотя это ограничено доступными датчиками и используемым спектральным диапазоном [13]. Возможно, удастся разделить один флуорофор между двумя парами FRET, уменьшив общее количество флуорофоров с четырех до трех [14].Другие подходы включают использование нефлуоресцентных акцепторов в сочетании с визуализацией времени жизни флуоресценции [15-17], использование гомо-FRET в сочетании с альтернативными показаниями, такими как анизотропия флуоресценции [18], и разделение спектрально перекрывающихся пар на основе ортогональной информации. , например, пространственная локализация зондов внутри клетки [19].

Несколько стратегий мультиплексирования зондов основаны на использовании фотохимии флуорофоров. Например, фотохромные метки демонстрируют индуцированное светом и обратимое переключение их флуоресцентного излучения «вкл-выкл» [20, 21].При возбуждении эти зонды демонстрируют яркое флуоресцентное излучение, которое со временем исчезает, хотя исходную флуоресценцию можно быстро восстановить, облучая светом с более короткой длиной волны. Эта динамика может использоваться для отделения сигнала фотохромной метки от сигнала нефотохромной метки или от автофлуоресценции, или может использоваться для разделения двух или более фотохромных меток, которые переключаются с разной кинетикой [22–26]. Однако сравнительно мало работ по оценке таких стратегий для одновременного измерения нескольких пар FRET.Напротив, фотохромизм акцептора использовался как способ обеспечения более точного количественного определения FRET [27, 28] или для измерения нескольких межмолекулярных донорно-акцепторных расстояний в одном и том же комплексе [29]. Предыдущая работа также исследовала использование фотохромного донора, где эффективность FRET может быть оценена путем определения скорости фотохромизма [30], или для облегчения считывания гомо-FRET на основе анизотропии [31]. Динамика флуоресценции, индуцированная ассоциацией, также использовалась для получения изображений биосенсоров без дифракции [32].

В этой статье мы описываем использование донорного фотохромизма для одновременного измерения более чем одной пары FRET, даже когда доноры и акцепторы демонстрируют полное спектральное перекрытие. Мы начинаем с разработки теории, лежащей в основе нашего метода, и проверяем его эффективность с помощью численного моделирования. Затем мы разрабатываем фотохромный биосенсор для цАМФ-зависимой протеинкиназы (PKA), которую мы называем rsAKARev, и используем его для демонстрации нашего подхода посредством одновременного измерения активности PKA и внеклеточной сигнальной киназы (ERK) в живых клетках.Наконец, мы демонстрируем универсальность нашего подхода, комбинируя эти датчики со спектрально-разделенным кальциевым биосенсором для одновременного биосенсинга трех различных сигнальных активностей в живых клетках.

Теория

Количественная оценка сигнала FRET

Целью измерения FRET является количественная оценка передачи энергии между донорным и акцепторным флуорофором. Мы предполагаем, что это измерение выполняется с использованием сенсибилизированной визуализации, когда донор возбуждается, а излучение от донора ( S DD ) и акцептора ( S DA ) измеряется одновременно или быстро. преемственность.В качестве контроля и для оценки эффектов фотодеструкции обычно также измеряют излучение акцептора при прямом возбуждении ( S AA ). Таким образом, полный сбор FRET состоит из трех измерений { S DD , S DA , S AA } в каждый момент времени и в каждом пикселе детектора.

Сигнал S DA обычно загрязнен сквозным донорским просачиванием и прямым перекрестным возбуждением акцепторов.Эти вклады можно количественно оценить с помощью явных поправочных коэффициентов α и δ [9]:

Эти поправочные коэффициенты могут быть определены с помощью контрольных измерений или могут быть оценены, зная спектры флуорофора и спектральную чувствительность прибора. Как правило, предпочтительны прямые контрольные измерения, так как они будут адаптированы к специфике прибора. Мы предполагаем, что прямое возбуждение акцептора не приводит к заметному излучению донорного флуорофора в акцепторном канале.

Не все экспериментаторы предпочитают определять эти поправочные коэффициенты, вместо этого количественно оценивая перенос энергии, используя «исходный» коэффициент выбросов R что уже позволит обнаруживать относительные изменения эффективности FRET. Однако, если они доступны, мы можем использовать поправочные коэффициенты для расчета сенсибилизированного излучения F c , которое представляет собой возбужденное донором излучение от акцептора с поправкой на перекрестные помехи:

Учитывая F c , реакцию FRET можно оценить с помощью коэффициента сенсибилизированных выбросов R c : R c можно сравнивать на разных приборах, и он более чувствителен к изменениям FRET, чем коэффициент выбросов R .Однако это не связано однозначно с абсолютной эффективностью FRET (), поскольку не учитывает различную яркость донорных и акцепторных флуорофоров и / или различную эффективность улавливания прибора. Введение дополнительного поправочного коэффициента γ [9] позволяет рассчитать эффективность FRET с использованием как указано в разделе 1 дополнительной информации. γ можно оценить по модельным спектрам или, более надежно, из дополнительных контрольных экспериментов [10].

Для некоторых систем, таких как генетически закодированные биосенсоры, изменения наблюдаемой эффективности FRET возникают из-за взаимного преобразования системы между состояниями с низким и высоким FRET, а не с постоянным изменением эффективности FRET. По этой причине мы будем называть результат уравнения (6) «кажущейся эффективностью FRET» при обсуждении измерений на биосенсорах FRET.

Введение фотохромного донора

Основная идея нашего метода состоит в том, что две разные пары FRET можно различить на основе фотохромизма доноров, концептуально показанного на рисунке 1a.Поэтому мы расширяем нашу модель на случай, когда донором является фотохромный флуорофор. Чтобы исследовать этот фотохромизм, мы расширили нашу схему измерения двумя периодами облучения, которые служат для переключения донорного флуорофора между флуоресцентным и нефлуоресцентным состояниями (рис. 1b). Он состоит из коротковолнового светового импульса и регистрации флуоресценции для фиксации флуоресцентного состояния, за которым следует более длинноволновый световой импульс и еще одна регистрация флуоресценции для определения степени выключения.Конечный результат состоит в том, что каждое получение FRET теперь заменяется двумя сборами, выполняемыми в конце каждого периода облучения, в общей сложности шесть измерений для каждой временной точки FRET (два измерения каждое для S DD , S DA и S AA ). S AA обычно изменяется медленно, потому что на него влияет только фотодеструкция или большие структурные изменения в образце, и поэтому его можно измерять с пониженной частотой.

Рисунок 1:

(a) Обзор концепции: две пары FRET можно различить, исследуя фотохромизм доноров, поскольку только фотохромные доноры реагируют на включение и выключение света. (b) Пример схемы облучения для голубого фотохромного белка, показывающий популяцию донора в активном состоянии (пунктирная линия) во время облучения фиолетовым и синим светом (цветные столбцы). Красные точки показывают выполненные измерения флуоресценции. На вставке показаны репрезентативные флуоресцентные изображения клетки HeLa, полученные во всех трех измерительных каналах.Масштабная линейка 20 мкм. На практике выключение, вызванное светом, не обязательно должно быть таким полным, как показано здесь.

Выключение донорского флуорофора приводит к снижению S DD , S DA и F c . Мы количественно оцениваем это, используя коэффициенты фотопереключения ρ D и ρ A , определяемые по формуле где "включено" и "выключено" получение данных показано на Рисунке 1b.Мы предоставляем два альтернативных определения ρ A в уравнении (8) в зависимости от того, доступны ли поправочные коэффициенты для перекрестных помех. Наша методология остается в силе для обоих подходов до тех пор, пока эти определения используются последовательно.

Коэффициенты фотопереключения ρ D и ρ A , таким образом, представляют собой доли исходной флуоресценции, которые остаются после применения выключенного облучения, с меньшими значениями, подразумевающими более выраженное выключение. -переключение.Они зависят от специфики донорского флуорофора и от общей доставляемой световой дозы, а также от эффективности FRET, поскольку этот процесс конкурирует с фотохромизмом. Этот аспект был усилен при разработке psFRET [30], и его также необходимо учитывать при разделении двух пар FRET на основе фотохромизма.

В общем случае зависимость от FRET коэффициентов фотопереключения ρ D и ρ A должна быть определена экспериментально путем их измерения для различных (сенсибилизированных) коэффициентов выбросов или эффективности FRET.Это можно сделать просто путем проведения эксперимента, в котором выражается пара FRET, и ρ D и ρ A отслеживаются как функция коэффициента выбросов или эффективности FRET. Этот подход также будет работать в более общем случае, когда контраст излучения возникает не только из-за передачи энергии, но и за счет других факторов, таких как изменение яркости донора.

Этот процесс можно упростить, если сделать соответствующие предположения о системе.Для простого процесса FRET с незначительными или полностью скорректированными перекрестными помехами, в котором присутствует только один вид, поскольку эмиссия акцептора пропорциональна количеству донора в флуоресцентном состоянии. Если мы далее предположим, что выключение можно описать собственным квантовым выходом, то коэффициент фотопереключения будет равен как указано в разделе 2 дополнительной информации. Уравнение (10) показывает, что полная зависимость известна, если просто измерить ρ 0 , коэффициент фотопереключения в отсутствие FRET, используя те же настройки для прибора.Как мы показываем в дополнительной информации, это рассмотрение можно распространить на фотохромные молекулы, которые не показывают полное выключение, а вместо этого достигают уровня равновесия или плато.

Хотя эти результаты могут упростить характеристику пар FRET, наш метод все равно будет работать, если эти предположения не могут быть сделаны. Остаточные перекрестные помехи прямого возбуждения акцепторов в канал S DA , например, увеличат A , поскольку этот вклад не показывает модуляции флуоресценции.Полученные модели также не применимы к биосенсорам на основе FRET, которые существуют как два взаимопревращающихся вида (активная и неактивная формы сенсора). Если никакие упрощающие предположения не могут быть сделаны, зависимость ρ A и ρ D от (сенсибилизированного) коэффициента выбросов или эффективности FRET необходимо будет определить во всем диапазоне значений, для каждой пары FRET и отключаемой световой дозы, использованной в эксперименте.

Разделение фотохромных пар FRET

Теперь предположим, что образец помечен двумя парами FRET, где спектры поглощения и излучения очень похожи, но доноры различаются по фотохромизму.Эта ситуация также может возникнуть, когда два разных взаимодействия исследуются с использованием двух доноров и одного общего акцептора. Записанные сигналы флуоресценции представляют собой просто сумму сигналов от отдельных компонентов. где «1» и «2» обозначают первую и вторую пару FRET. После облучения выключенным светом также получаем

Наши измерения обеспечивают сигналы S DD и S DA до и после выключения.Если предположить, что все четыре коэффициента фотопереключения ρ A и ρ D известны, то эти уравнения составляют систему из четырех уравнений и четырех неизвестных, которые можно решить для получения DD , на и S DA , на для обоих видов. Эти значения затем могут быть легко использованы для получения (сенсибилизированных) коэффициентов излучения для каждой пары с использованием уравнений (3) или (5) или эффективности FRET с использованием уравнения (6).В принципе, тот же подход может быть использован для разделения двух пар FRET, состоящих из одного фотохромного донора, флуоресцентного и темного (нефлуоресцентного) акцептора.

На практике нам неизвестны четыре значения ρ D и ρ A , поскольку они зависят от желаемого (сенсибилизированного) коэффициента выбросов или эффективности FRET. Однако в предыдущем разделе было рассмотрено, как определить взаимосвязь между этими параметрами.Учитывая эту информацию, мы рекомендуем использовать итерационную процедуру, в которой (сенсибилизированный) коэффициент излучения или эффективность FRET рассчитывается, исходя из начальных предположений для коэффициентов фотопереключения. Это значение затем используется для получения более точных предположений для коэффициентов фотопереключения, и эта процедура повторяется до тех пор, пока эти значения не сойдутся, что на практике происходит быстро. Более подробное обсуждение алгоритма, используемого в этой работе, можно найти в разделе 3 дополнительной информации.

Мы разработали серию численного моделирования, чтобы проверить правильность нашего подхода. Мы предположили, что образец помечен двумя спектрально неразличимыми парами FRET, где один из доноров является фотохромным и может быть описан с помощью уравнения (10), а другой не показывает заметного фотохромизма. Мы также предположили разные уровни яркости, отраженные в количестве фотонов, которые были бы получены при «включении», если бы не было FRET. Шум был включен в наши измерения путем моделирования пуассоновского шума, присущего процессу регистрации фотонов.Для каждого условия мы выполнили 5000 симуляций, в которых мы выбрали случайную достоверную эффективность FRET от 0 до 0,6 для каждой пары FRET и сгенерировали два имитированных сбора флуоресценции до и после выключения (см. Схему измерения, показанную на рисунке 1b). . Затем эти данные были проанализированы с использованием нашей методологии, в результате чего были получены оценки эффективности FRET для каждой из пар. Затем точность этих результатов была определена количественно с использованием среднего абсолютного отклонения, определяемого по формуле где Θ i - истинная эффективность FRET, а - эффективность FRET, оцененная с помощью нашего метода.В качестве отрицательного контроля мы также включили результат анализа, который просто генерировал случайные значения эффективности FRET.

Наше моделирование показывает, что наш анализ хорошо работает уже при низких уровнях освещенности, обеспечивая точные результаты при обнаружении 1000 или более фотонов и менее точные, но полезные результаты уже при уровнях сигнала всего 250 фотонов (рис. 2a). Мы также исследовали, в какой степени разница в фотохромизме доноров FRET (Δ ρ ) определяет точность анализа (рисунок 2b и дополнительный рисунок 1).Мы обнаружили, что это зависит от ожидаемой эффективности FRET и коэффициента фотопереключения донора при отсутствии FRET ( ρ 0 ). Однако ρ 0 0,3 или ниже, что легко достижимо, например, с помощью фотохромные флуоресцентные белки хорошо работают в широком диапазоне эффективностей FRET. Кроме того, ρ 0 можно увеличивать или уменьшать, регулируя продолжительность или интенсивность выключенного освещения, позволяя адаптировать условия к измерению.Наконец, мы отмечаем, что дальнейшее повышение точности возможно за счет включения большего количества регистраций флуоресценции как части выключения (добавление дополнительных регистраций флуоресценции к каждому из циклов измерения, показанных на рисунке 1b).

Рисунок 2:

Производительность нашего метода на смоделированных данных. (а) Объединенная скрипка и диаграмма среднего абсолютного отклонения (MAD) нашего подхода к анализу для различного количества обнаруженных фотонов. Данные были получены путем выполнения 5000 независимых симуляций для каждой категории.(b) Диаграмма рассеяния, показывающая эффективность анализа для различных эффективностей FRET и коэффициентов фотопереключения (в отсутствие FRET) фотохромных ( ρ 0, p ) и нефотохромных ( ρ 0, нп ) донор. 2D проекции этих данных показаны на дополнительном рисунке 1.

В принципе, нашу методологию можно использовать для разделения более двух перекрывающихся пар FRET, добавляя дополнительные члены к уравнениям (11) - (14).Каждая дополнительная пара потребует одного дополнительного сбора флуоресценции за цикл переключения.

Результаты и обсуждение

rsAKARev: фотохромный биосенсор для PKA

Мы решили экспериментально проверить наш метод, разработав фотохромный биосенсор на основе FRET для определения активности цАМФ-зависимой протеинкиназы (PKA), названный rsAKARev (обратимо переключаемая A-kinase). репортер активности с EV-линкером). Мы получили этот биосенсор, заменив донор и акцептор в AKAR3ev [33] на голубой флуоресцентный белок mTFP0.7 и желтый флуоресцентный белок cpVenus172. mTFP0.7 - это вариант яркого и фотостабильного mTFP1 [34], который демонстрирует эффективный фотохромизм с небольшой утомляемостью [35]. cpVenus172 - круговой пермутант Венеры, который, как сообщается, приводит к улучшенному контрасту FRET [36–38]. Чтобы оценить нашу стратегию разделения, мы решили объединить rsAKARev с нефотохромным биосенсором EKARev [33], который сообщает об активности киназы, регулируемой внеклеточными сигналами (ERK), и состоит из голубого донора ECFP и желтого акцептора YPet.Наш выбор сенсоров отражает фундаментальный интерес к взаимодействиям между консервативными путями передачи сигналов cAMP / PKA и MAPK / ERK, которые регулируют различные физиологические процессы, включая пролиферацию и рост клеток [39, 40].

Чтобы охарактеризовать производительность наших биосенсоров, мы провели измерения на клетках, экспрессирующих либо rsAKARev, либо EKARev, и представили их в схеме измерения, показанной на рисунке 1b. Как и ожидалось, мы обнаружили, что флуоресцентное состояние донорного флуорофора rsAKARev, mTFP0.7, легко распадается при облучении синим светом и может быть эффективно восстановлен при слабом облучении фиолетовым светом (рис. 3а). Этот донорный фотохромизм приводит к большому и обратимому контрасту флуоресценции в эмиссии донора и акцептора с минимальной потерей интенсивности флуоресценции (рис. 3b). Напротив, донор EKARev, ECFP, демонстрирует гораздо более ограниченную модуляцию сигнала флуоресценции (рис. 3c).

Рисунок 3:

Поведение фотохромизма rsAKARev и EKARev, экспрессируемых в клетках HeLa.(а) Типичные флуоресцентные изображения донорной ( S DD ) и акцепторной ( S DA ) флуоресценции rsAKARev до и после выключения. Шкала, 40 мкм (b, c) Динамика эмиссии донора и сенсибилизированного акцептора rsAKARev (b) и EKARev (c) во время нескольких циклов облучения. (d, e) Типичные ответы клетки HeLa, экспрессирующие rsAKARev (d) или EKARev (e), во время стимуляции активности PKA или ERK. Следы времени окрашены, как указано.Активность PKA стимулировали форсколином (Fsk, 50 мкМ) и IBMX (100 мкМ), активность ERK - PMA (1 мкМ).

Затем мы оценили, как состояние активации каждого биосенсора влияет на его флуоресцентное излучение. Клетки обрабатывали фармакологическими соединениями, чтобы вызвать активность киназы PKA или ERK, и отслеживали реакцию FRET соответствующего биосенсора с течением времени (фиг. 3d, e). Этот ответ был определен с помощью обычного анализа FRET с использованием только «включенной» флуоресценции, полученной после каждого этапа фиолетового облучения на рисунке 1b.

Форсколин- (Fsk) и 3-изобутил-1-метилксантин (IBMX) -опосредованное повышение внутриклеточного цАМФ сильно увеличивало FRET-ответ rsAKARev. Сходным образом стимуляция клеток форбол-12-миристат-13-ацетатом (PMA), который действует на ERK через вышестоящие киназы [41, 42], вызвала сильный ответ EKARev. Как и ожидалось, наши данные дополнительно показали, что изменения в активности PKA также приводят к изменениям коэффициентов фотопереключения ? D и ? A (рис. 3d).И наоборот, рисунок 3e показывает, что динамика флуоресценции EKARev, вызванная облучением, невелика и в значительной степени не зависит от состояния активации датчика, что согласуется с фотостатической природой ECFP.

Как мы обсуждали в теории, разделение перекрывающихся пар FRET на основе их фотохромизма требует знания взаимосвязи между коэффициентом фотопереключения и эффективностью FRET. Для процессов FRET с хорошим поведением это можно сделать, используя только одно эталонное измерение и аналитическое выражение зависимости (например,грамм. Уравнение (10)). Однако системы, которые состоят из равновесия между несколькими дискретными состояниями, такими как активное и неактивное состояние биосенсора, не могут быть описаны с помощью этого отношения. Более того, голубые флуоресцентные белки обычно демонстрируют сложное спектроскопическое поведение, такое как многоэкспоненциальное уменьшение времени жизни возбужденного состояния [43]. Поэтому мы прибегли к прямому измерению полной зависимости в клетках, экспрессирующих либо rsAKARev, либо EKARev (рис. 4). Мы обнаружили, что искомую взаимосвязь можно эмпирически описать с помощью двухэкспоненциальной (rsAKARev) или прямой (EKARev) аппроксимации, обеспечивая модель, которая использовалась в последующем анализе.Рисунок 4b действительно показывает, что коэффициент фотопереключения увеличивается с уменьшением видимой эффективности FRET, что противоречит тому, что можно было бы ожидать от системы FRET с двумя состояниями. Вероятно, это связано с неоптимальным значением поправки на просачивание акцептора, хотя это не мешает последующему анализу разделения, поскольку его эффекты автоматически учитываются с помощью этой калибровки in situ .

Рисунок 4:

Связь между кажущейся эффективностью FRET и коэффициентом фотопереключения излучения донора (a, c) и эмиссии возбужденного донором акцептора (b, d), как определено в экспериментах с одним сенсором на клетках COS-7, экспрессирующих rsAKARev (оранжевый) или Клетки HeLa, экспрессирующие EKARev (синий). n = 99 (rsAKARev) или 41 (EKARev) клетки из 1 эксперимента. Сплошные линии представляют эмпирические функции подгонки для rsAKARev (двойная экспонента) или EKARev (прямая линия), которые использовались для последующего анализа.

Одновременное измерение двух перекрывающихся биосенсоров FRET

Затем мы сосредоточились на одновременном измерении rsAKARev и EKARev, экспрессируемых в одних и тех же клетках. Поскольку спектры излучения обоих биосенсоров по существу неразличимы, их ответы было бы трудно разделить на основе классической визуализации FRET.Чтобы создать предсказуемые профили ответа для rsAKARev и EKARev, мы последовательно обрабатывали клетки с помощью PMA, Fsk / IBMX, U0126 и H-89. U0126 и H-89 являются ингибиторами, которые изменяют ответы сигнальных путей MAPK / ERK и PKA соответственно [17]. В идеале эта последовательность манипуляций должна приводить к различимым профилям ответа для rsAKARev и EKARev.

Первоначально мы проводили эти эксперименты на клетках, экспрессирующих один биосенсор, либо rsAKARev, EKARev, или неактивных мутантах, в которых треонин-мишень киназы был мутирован в аланин, что обозначено суффиксом «(T / A)».Мы подвергли эти клетки схеме измерения, показанной на рисунке 1b, но проанализировали полученные ответы двумя разными способами: либо с помощью обычного анализа на основе интенсивности, используя только изображения флуоресценции, полученные после каждого этапа фиолетового облучения (рисунок 5a, d, g) или с помощью нашего подхода, основанного на полном фотохромизме (рис. 5b, e, h). Применение обеих методик анализа к одним и тем же данным позволяет обнаружить любые расхождения между полученными результатами. Подробная информация о процедуре анализа представлена ​​в разделе 3 дополнительной информации.

Рисунок 5:

сигнальных ответов PKA и / или ERK в клетках HeLa, экспрессирующих один (левая средняя панель) или два (правая панели) биосенсора FRET. Ответы rsAKARev, rsAKARev (T / A), EKARev и EKARev (T / A) изображены для столбцов в соответствии с методом анализа. Пунктирные темные кривые указывают на результаты, полученные с использованием обычного анализа на основе сенсибилизированного излучения, а сплошные светлые кривые указывают на результаты, полученные с использованием анализа на основе фотохромизма, представленного здесь. Все кривые представляют собой среднюю кажущуюся эффективность FRET плюс стандартное отклонение (заштрихованная область). n = 75 (rsAKARev), 132 (EKARev), 12 (rsAKARev (T / A)), 42 (EKARev (T / A)) клеток для односенсорных экспериментов и 80 (rsAKARev + EKARev), 50 (rsAKARev) (T / A) + EKARev), 22 (rsAKARev + EKARev (T / A)) клеток для двухсенсорных экспериментов из 3, 2, 1, 1 и 2, 1, 1 независимых экспериментов соответственно. Клетки стимулировали PMA (1 мкМ), форсколином (Fsk, 50 мкМ) и IBMX (100 мкМ), U0126 (20 мкМ) и H-89 (20 мкМ).

Традиционный анализ показывает, что биосенсоры ожидаемо реагируют на фармакологическое лечение (рис. 5а).Мы действительно наблюдали ингибирование сигнала EKARev при добавлении Fsk / IBMX, что напоминает предыдущие сообщения, в которых было обнаружено, что форсколин мешает EGF-опосредованной активации ERK [17]. Это предполагает, что аналогичный механизм также задействован при стимуляции активности ERK с помощью PMA. Как и ожидалось, реакция биосенсора мутантов T / A оставалась нечувствительной к применяемой последовательности манипуляций. Добавление Fsk / IBMX действительно вызывает снижение ответа EKARev (T / A), подобное тому, которое наблюдается для EKARev, демонстрируя, что этот ответ возникает в результате процесса, отличного от фосфорилирования целевого остатка.Мы также наблюдали более слабое, чем ожидалось, ингибирование сигнала rsAKARev при добавлении H-89. Однако дополнительные эксперименты с использованием свежего образца H-89 показали ожидаемую обратимость реакции биосенсора (дополнительный рисунок 2), демонстрируя, что ограниченная обратимость, обнаруженная здесь, была вызвана плохо работающей партией H-89.

Результаты обычного анализа и нашей новой стратегии разделения отлично согласуются для экспериментов с одним датчиком, воспроизводя те же характеристики и отклики.Взятые вместе, различия между основанным на фотохромизме и традиционным анализом невелики и вряд ли будут важны для всех, кроме самых требовательных количественных экспериментов.

Подтвердив нашу стратегию на уровне отдельных биосенсоров, мы перешли к клеткам, одновременно экспрессирующим как rsAKARev, так и EKARev. Наш анализ воспроизводит по существу те же тенденции, что и для случая с одним датчиком (рис. 5c, f, i), демонстрируя, что мы действительно можем разделить две пары FRET, которые демонстрируют практически полное спектральное перекрытие.Мы действительно обнаружили, что одновременная визуализация двух биосенсоров приводит к снижению отношения сигнал / шум разделенных ответов (дополнительные рисунки 3 и 4), что согласуется с дополнительной обработкой, необходимой для разделения сигналов, хотя клеточные ответы могут все еще можно легко проверить.

Мультиплексное обнаружение трех сигнальных активностей

Наша стратегия разделения может быть напрямую скомбинирована с другими спектрально различающимися флуорофорами или сенсорами. В качестве доказательства концепции мы одновременно экспрессировали rsAKARev и EKARev вместе с кальциевым сенсором RCaMP со смещением в красную область [44].Известно, что кальций модулирует сигнальную активность белков как в сигнальных путях cAMP / PKA [45, 46], так и в MAPK / ERK [47]. Кроме того, было показано, что PKA-опосредованная активация фактора транскрипции CREB происходит через MAPK / ERK и опосредуется высвобождением кальция из внутриклеточных хранилищ [48]. Такие зависимости между путями иллюстрируют потенциал многопараметрического биосенсинга.

Мы последовательно стимулировали клетки с помощью Fsk / IBMX, эпидермального фактора роста (EGF), иономицина и CaCl 2 , чтобы вызвать различимые профили ответа.Иономицин - это ионофор, который переносит ионы Ca 2+ через липидные бислои, что приводит как к высвобождению кальция из внутриклеточных запасов, так и к поглощению кальция из внешней среды или утечке во внешнюю среду. CaCl 2 добавляли в качестве внутреннего контроля для ответа RCaMP. Схематический обзор стимулированных сигнальных путей можно найти на дополнительном рисунке 5.

Используя нашу стратегию, ответы rsAKARev и EKARev можно было различить на основе их фотохромизма, в то время как ответ RCaMP с красным смещением можно было разделить на основе его различий. длины волн возбуждения и излучения.На рис. 6а показаны ответы трех биосенсоров для всех 129 проанализированных клеток. Графики для каждого отдельного биосенсора можно найти на дополнительном рисунке 6 вместе с изображениями репрезентативных клеток (дополнительный рисунок 7) и их соответствующие ответы (дополнительный рисунок 8). Чтобы упростить последующее обсуждение, мы также визуально обозначим три разных временных интервала во время нашего измерения в верхней части рисунка 6а.

Рисунок 6:

Эксперимент по разделению трех биосенсоров на клетках HEK293T, одновременно экспрессирующих биосенсоры rsAKARev, EKARev и RCaMP.(а) Ответы RCaMP (красный), EKARev (зеленый) и rsAKARev (синий) с цветовым кодированием RGB. (b) Трехмерный график разброса максимального ответа, окрашенный кластеризацией каждой ячейки. (c, d, e) коробчатые диаграммы максимального ответа, наблюдаемого для rsAKARev (c), RCaMP (d) и EKARev (e) в течение указанных интервалов времени. «*» Указывает на значительную разницу (p <0,01, двухвыборочный t-тест после F-теста для равных дисперсий (p <0,05)). n = 129 клеток из 1 эксперимента. Клетки стимулировали форсколином (Fsk, 50 мкМ) и IBMX (100 мкМ), EGF (1 мкг / мл), иономицином (Iono, 10 мкМ) и CaCl 2 (2 мМ).

Как и ожидалось, стимуляция Fsk / IBMX (интервал 1) сильно увеличивает активность PKA во всех клетках, дополнительно показывая, что повышение уровня цАМФ также опосредует временный кальциевый ответ. Это согласуется с предыдущей работой, описывающей перекрестные помехи, происходящие через PKA-опосредованное высвобождение кальция из ER-хранилищ [49, 50]. Затем стимуляция EGF приводит ко второму высвобождению кальция (интервал 2) [51, 52] и к задержке активности ERK (интервал 3) с различными ответами клеток. Начало ответа ERK частично совпадает с добавлением иономицина, хотя этот ответ уже инициируется до добавления в большинстве клеток и достигает плато к тому времени, когда становится очевидным индуцированное иономицином высвобождение кальция (дополнительные рисунки 6 и 8).В совокупности это говорит о том, что иономицин оказывает незначительное влияние на активность ERK или не влияет на него.

Визуальный осмотр данных показал неоднородность клеточных ответов (рис. 6а). Мы количественно оценили максимальный ответ и время ответов биосенсора в пределах каждого интервала (см. Методы, дополнительный рисунок 9) и обнаружили, что кластеризация k-средних может разделить клеточные ответы на три класса на основе их максимальных ответов, визуально показанных на рисунках 6b и подтверждено с помощью дискриминантного анализа методом частичных наименьших квадратов (дополнительный рисунок 10).

Максимальный отклик различных датчиков показал значительные различия между классами (рис. 6c-e). Стимуляция Fsk / IBMX, по-видимому, имеет немного более сильный эффект на активность PKA в клетках класса 2, хотя это, по-видимому, не приводит к более высокому переходному уровню кальция, который в целом был очень вариабельным. Наиболее поразительными являются межклассовые различия в передаче сигналов кальция (интервал 2) и ERK (интервал 3) при стимуляции EGF. Более конкретно, клетки в пределах классов 1 и 2 сильно реагируют на EGF-опосредованную активацию ERK, тогда как действие на клетки класса 3 довольно слабое и происходит с дополнительной задержкой (дополнительный рисунок 9h).Кроме того, размеры ответов ERK, по-видимому, не связаны с увеличением предшествующего высвобождения кальция.

Эти результаты показывают возможность классификации клеток на основе гетерогенности их ответов, хотя из данных не сразу ясно, откуда эта гетерогенность, или если различия в сигнальной активности трех путей биологически коррелируют в контекст этого эксперимента.

Плохая экспрессия рецепторов EGF [53, 54] или цАМФ-опосредованные эффекты, вызванные Fsk / IBMX [55], могут сделать некоторые клетки менее чувствительными к стимуляции EGF, в то время как дальнейшая гетерогенность также может быть обусловлена ​​высокими уровнями вариабельности, связанной с Клетки HEK293 [56].

Взятые вместе, наши данные дополнительно подтверждают идею о том, что одновременная визуализация нескольких биосенсоров может легко выявить неоднородности даже в хорошо зарекомендовавших себя системах, одновременно демонстрируя, что нашу схему можно легко комбинировать со спектрально-ортогональными биосенсорами для дальнейшего расширения диапазона ответов. что можно измерить.

Выводы

В этой работе мы решили разделить вклады двух или более спектрально перекрывающихся пар FRET на основе фотохромизма донорных флуорофоров, отслеживая их реакцию на облучение выключенным светом.Мы разработали структуру для выполнения анализа и подтвердили ее применимость с помощью численного моделирования. Мы обнаружили, что наш метод может давать точные результаты уже при низких уровнях освещенности, хотя конкуренция между процессом FRET и фотохромизмом должна быть охарактеризована для каждой из пар FRET.

Затем мы применили нашу методологию к биосенсорам на основе FRET, многие из которых используют голубые и желтые флуоресцентные белки. Мы показали, что голубой флуоресцентный белок mTFP0.7 может быть использован для создания фотохромного биосенсора для определения активности PKA, который мы назвали rsAKARev.Мы объединили этот сенсор со спектрально перекрывающимся биосенсором EKARev, репортером активности киназы ERK, и показали, что вклад обоих сенсоров можно легко разделить при одновременной экспрессии в живых клетках. Наконец, мы расширили эти эксперименты, включив дополнительный репортер для Ca 2+ , и показали, что этот подход может обнаруживать клеточную гетерогенность в ответ на фармакологическую стимуляцию. Наш метод дополнительно иллюстрирует возможность одновременного получения нескольких сигнальных ответов для исследования сложных биологических сетей.

Наш метод легко совместим с существующими трубопроводами измерения или анализа, которые могут использовать исходный коэффициент выбросов, коэффициент сенсибилизированных выбросов или вычисленную эффективность FRET при условии, что один из них характеризует зависимость между этим показателем и коэффициентом фотопереключения. На практике это, вероятно, потребует отдельного измерения для каждой пары FRET, где коэффициент фотопереключения отслеживается по различным коэффициентам излучения или эффективности FRET. Такое измерение должно выполняться только один раз для каждой пары FRET и выключенной световой дозы.Метод может быть легко интегрирован с установленным оборудованием, требуя только возможности включения и выключения излучения между двумя измерениями FRET.

В принципе, нашу процедуру можно использовать для разделения вкладов более чем двух пар FRET при условии, что доноры достаточно разделены с точки зрения их фотохромизма. Наше использование двух биосенсоров также отражает ограниченную доступность фотохромных голубых флуоресцентных белков, хотя гораздо больше возможностей доступно при рассмотрении также фотохромных зеленых и красных флуоресцентных белков, которые были бы напрямую совместимы с нашим методом.

Таким образом, мы показали, что фотохромизм донора может быть усилен для достижения мультиплексирования FRET с использованием простой линейной схемы несмешивания при условии, что отклики пар FRET хорошо охарактеризованы. Наша стратегия может быть легко использована как часть экспериментов, требующих множественного взаимодействия и биочувствительности.

Методы

Конструирование биосенсора

Экспрессионные плазмиды были получены с использованием комбинации полимеразной цепной реакции (ПЦР), расщепления рестрикционным ферментом и методов молекулярного клонирования сборки Гибсона.Для реакций сборки Гибсона векторную ДНК расщепляли рестрикционными ферментами, разрезающими сайт множественного клонирования. Все остальные фрагменты ДНК были получены с помощью ПЦР с Q5-полимеразой с использованием последовательностей праймеров с оптимальной температурой отжига 72 ° C, рассчитанной с помощью калькулятора NEB Tm (https://tmcalculator.neb.com), и с минимальным перекрытием 20 -основные пары между соседними фрагментами. Затем все фрагменты очищали с помощью экстракции гелем и затем объединяли в реакции сборки Гибсона в соответствии с инструкциями производителя.rsAKARev был получен путем замены кДНК для YPet и ECFP в AKAR3EV (вектор pcDNA3.1 +) на кДНК для mTFP0.7 и cpVenus172, соответственно. Для rsAKARev (T / A) праймеры PCR были модифицированы для введения мутации T / A в субстратную область PKA. Для создания EKARev (T / A) были разработаны праймеры для ПЦР для введения мутации T / A в субстратную область ERK.

Культура клеток и трансфекция

Клетки HeLa, COS-7 и HEK293T культивировали в среде Игла, модифицированной Дульбекко (DMEM; Gibco, # 31053028) с добавлением 10% (об. / Об.) Фетальной бычьей сыворотки (FBS; Gibco, # 70011036). ), 1X Glutamax (Gibco, # 35050061) и 50 мкг / мл гентамицина (GM; Sigma-Aldrich, # 15750060) и выдерживали в увлажненном инкубаторе (37 ° C, 5% CO 2 ).За 24 часа до трансфекции клетки высевали на стерильные чашки со стеклянным дном диаметром 35 мм (MatTek) и выращивали до 30-70% конфлюэнтности. Затем клетки трансфицировали за 24-48 часов перед визуализацией с использованием реагента для трансфекции FuGENE6 (Promega) и плазмидной ДНК в соответствии с протоколом производителя. Для получения оптимальных результатов трансфекции 90 мкл DMEM, содержащего 3 мкл FuGENE6, смешивали с 10 мкл сверхчистой воды, содержащей всего 1 мкг ДНК, путем тщательного пипетирования, и каждую смесь оставляли не менее чем на 20 минут перед добавлением в каждую чашку по каплям.Для экспериментов с несколькими биосенсорами относительные количества плазмидной ДНК были оптимизированы для получения сопоставимой экспрессии всех конструкций. Затем клетки выращивали еще в течение 24 часов (HeLa) или 48 часов (HEK293T, COS-7) перед визуализацией. Наконец, клетки были переведены на среду с пониженным содержанием сыворотки, содержащую DMEM (HEK293T, COS-7) или FluoroBrite DMEM (Gibco, # A1896702) (HeLa), с добавлением 0,5% (об. / Об.) FBS, 1X глутамакса и 50 мкг / мл GM. 4-6 часов (HEK293T) или 16-20 часов (COS-7, HeLa) до визуализации.

Покадровая флуоресцентная визуализация

Обработка клеток

Перед визуализацией чашки со стеклянным дном 35 мм дважды осторожно промывали фосфатно-солевым буфером (PBS; Gibco, # 70011036), а затем отображали в темноте в любом не содержащем кальция растворе Хэнкса. сбалансированный солевой раствор (HBSS; Gibco, # 14185052) с добавлением 0.2% (мас. / Об.) Бычьего сывороточного альбумина (BSA; Gibco, # 10270106) (HEK293T, COS-7) при комнатной температуре или во FluoroBrite DMEM с добавлением 0,5% (об. / Об.) FBS и 1X глутамакса (HeLa) при 37 ° C, 5% CO 2 . Клетки обрабатывали в указанные моменты времени, используя конечную концентрацию 50 мкМ форсколина (Fsk) (Sigma-Aldrich, # 93049), 100 мкМ 3-изобутил-1-метилксантина (IBMX) (Sigma-Aldrich, # 410957), 1 мкг / мл эпидермального фактора роста (EGF) (R&D Systems, # 236-EG10), 10 мкМ иономицина (Iono) (Sigma-Aldrich, # 407950), 2 мМ CaCl 2 (Chem-Lab Analytical, # CL05.0371), 1 мкМ форбол-12-миристат-13-ацетат (PMA) (Sigma-Aldrich, # P1585), 20 мкМ U0126 (Sigma-Aldrich, # 662005) и 20 мкМ H-89 (Sigma-Aldrich, # B1427 ) путем смешивания 5-кратного концентрированного раствора, приготовленного в буфере для визуализации из свежеоттаявших запасов DMSO (Fsk, IBMX, PMA, U0126, H-89) или HBSS (CaCl 2 ), в чашку для визуализации.

Оборудование

Изображения получали на инвертированном микроскопе Olympus IX-71, соединенном с Spectra X Light Engine (Lumencor), объективом 10 × UplanSApo (Olympus), ORCA-Flash5.0 LT (Hamamatsu), моторизованная турель флуоресцентного куба IX2-RFACA (Olympus), устройство смены оптических фильтров Lambda 10-B (Sutter) и высокоточный моторизованный столик h217 (Prior). Все оборудование контролировалось с помощью собственного программного обеспечения. Эксперименты, проведенные при 37 ° C, 5% CO 2 , были выполнены с использованием инкубатора с верхним столиком (h401-NIKON-TI-S-ER, OKOLAB), соединенного с блоком цифрового контроллера CO2 (CO2-UNIT-BL, OKOLAB). .

Получение изображения

Следуя обозначениям теории, S DD , S DA и S AA канала обнаружения DD , S DA ) или ZT514RDC ( S AA ) дихроичное зеркало и ET480 / 40m ( S

) S DA , S AA ) эмиссионный фильтр (все Chroma).Каждый образец возбуждали синим светом (438/29 нм, 35,6 мВт; S DD , S DA ) или бирюзовым светом (513/22 нм, 2,45 мВт; S AA ). Интенсивность RCaMP регистрировали с использованием дихроичного фильтра ZT561rdc и эмиссионного фильтра HQ572lp (вся цветность) с возбуждением зеленым светом (542/33 нм, 39,0 мВт). Все изображения были получены при выдержке камеры 50 мс. Каждый сбор данных выполнялся в течение постоянных интервалов времени каждые 10-30 секунд в нескольких положениях образца.

Параметры облучения для фотохромизма были определены как минимальная доза света, необходимая для достижения устойчивой флуоресценции во время включения и выключения mTFP0,7, что достигается облучением 0,2 с фиолетовым светом (390/22 нм, 26,7 мВт) и 0,2 с. s с синим светом (438/29 нм, 78,35 мВт) соответственно. S DD и S DA флуоресценция регистрировалась после каждого этапа облучения; S AA флуоресценция была получена только для подмножества временных точек, чтобы минимизировать фотообесцвечивание акцептора.

FRET-анализ

Анализ временного ряда флуоресценции был выполнен с использованием собственного программного обеспечения для анализа, работающего на Igor Pro 8 (WaveMetrics). Для каждой позиции образца были определены несколько областей интереса (ROI), соответствующие отдельным ячейкам, и средняя интенсивность по форме ячейки была определена в каждый момент времени. Впоследствии интенсивность была скорректирована по фону путем вычитания среднего сигнала области за пределами границ ячеек. Эту коррекцию можно улучшить, вместо этого вычитая сигнал, наблюдаемый для нетрансфицированных клеток, хотя мы не преследовали этого здесь, поскольку излучение от нетрансфицированных клеток было намного меньше, чем как фон, так и излучение от трансфицированных клеток.Полученные средние значения интенсивности использовались для последующего анализа.

Для обычного FRET-анализа экспериментов с одним сенсором, эффективность FRET была впоследствии рассчитана в соответствии с уравнением (6) с использованием только флуоресценции с поправкой на фон, обнаруживаемой после каждого этапа фиолетового облучения в схеме измерения, показанной на рисунке 1b. Анализ фотопереключения экспериментов с одним и двумя биосенсорами был выполнен, как подробно описано в теории, с использованием уравнений (11) - (14). Более подробно процедура анализа описана в дополнительном разделе 3.

Из экспериментов с одним датчиком зависимости ρ (Θ) были определены эмпирически путем подбора двойной экспоненциальной функции (rsAKARev) или прямой линии (EKARev) на объединенных данных ячеек, представленных на рисунке 4, с использованием регрессии ортогонального расстояния.

Коэффициенты α , δ и γ (дополнительная таблица 1) были рассчитаны на основе опубликованных значений квантового выхода флуоресценции (QY), параметров прибора и имеющихся спектральных данных в базе данных флуоресцентных белков FPbase [57] , как описано в разделе 4 дополнительной информации.

Эксперимент по несмешиванию с тремя биосенсорами

Эффективность FRET для rsAKARev и EKARev получали, как описано выше. Необработанные значения интенсивности RCaMP были получены путем усреднения соответствующего излучения по тем же интересующим областям, а также включали удаление фона путем вычитания сигнала из интересующей области, в которой не было никаких клеток.

Мы обнаружили, что следы FRET и RCaMP показали постепенное уменьшение амплитуды, которое мы связываем с фотообесцвечиванием флуорофоров.Мы исправляем это, используя базовую линию, которая определяется для каждой трассы.

Для измерений FRET базовая линия определяется путем подгонки кривой с помощью функции где множитель в скобках - стандартная сигмоидальная функция. Базовая линия тогда определяется как b e - t / τ . τ обычно намного больше, чем продолжительность эксперимента.

Для измерений RCaMP мы оценили базовую линию, используя двухэкспоненциальную функцию для тех частей кривой, которые не показывают повышенного сигнала кальция.

Затем мы рассчитали ответы как где «сигнал» - это эффективность FRET для rsAKARev и EKARev, а интенсивность флуоресценции для RCaMP. Полученные ответы показаны на рисунке 6a, где мы вручную оптимизировали масштабирование цвета, чтобы выделить клеточные ответы. Мы дополнительно показываем примерные кривые, соответствующие им исходные уровни и рассчитанные ответы на дополнительных рисунках с 11 по 13. Ответы клеток на фармакологическую стимуляцию количественно оценивали, принимая значение максимального ответа, наблюдаемого в течение временного интервала после стимуляции.

Время начала ответов биосенсора FRET было определено как время, в течение которого сигмоидальное соответствие ответа увеличивается до 7,6% от его максимального значения, в то время как время начала данных RCaMP было определено как момент времени, в который вторая производная ответа достиг максимального значения.

Частичная кластеризация k-средних была выполнена в Matlab R2019b на основе ответов, определенных для rsAKARev за интервал времени 1, для RCaMP за интервал времени 2 и для EKARev за интервал времени 3.Чтобы проверить результаты классификации кластеризации K-средних, был проведен дискриминантный анализ частичных наименьших квадратов (PLS-DA) для наборов данных трассировки за полный рабочий день (% увеличения), предполагая, что три класса получены кластеризацией K-средних. Впоследствии результаты кластеризации были проверены с помощью модели PLS-DA с использованием 95% доверительного интервала. Дополнительная информация доступна в разделе 5 дополнительной информации.

Статистика и воспроизводимость

Все статистические тесты были выполнены в GraphPad Prism 5 (программное обеспечение GraphPad).Все данные были проверены на нормальность с помощью комплексного теста D’Agostino & Pearson. Затем было проведено попарное сравнение с использованием непарного двустороннего t-критерия Стьюдента или критерия неравной дисперсии Велча для гауссовских данных или с использованием U-критерия Манна-Уитни для негауссовских данных со значимостью, установленной на уровне P <0,01.

Ускоренная микроскопия FRET-PAINT | Молекулярный мозг

Ускоренная диссоциация донорных цепей

Экспериментальная схема FRET-PAINT и приборная установка кратко представлены на рис.1а. В предыдущей работе мы использовали EMCCD (iXon Ultra DU-897 U-CS0- # BV, Andor) с максимальной частотой кадров 56 Гц и областью изображения 512 × 512. Однако из-за медленной диссоциации ДНК-зондов фактическая частота кадров составляла 10 Гц. В этой работе мы заменили EMCCD камерой sCMOS (ORCA-Flash 4.0 V2, Hamamatsu) с максимальной частотой кадров 400 Гц для того же размера области изображения. Однако из-за фотоиндуцированного повреждения ДНК-зондов, которое будет объяснено более подробно позже, максимальная используемая частота кадров составляла 200 Гц.Чтобы компенсировать короткое время экспозиции, интенсивность освещения следует увеличивать пропорционально частоте кадров. По той же причине фотоиндуцированного повреждения ДНК мы использовали мощность освещения 1,5 кВт / см 2 , что всего в 3,3 раза больше, чем 460 Вт / см 2 , которые использовались в предыдущей работе.

Рис. 1

| Ускоренная диссоциация донорских цепей. ( a ) Схема микроскопии FRET-PAINT. Акцептор флуоресцирует только через FRET, а его сигнал улавливается высокоскоростной камерой sCMOS.Донорный сигнал отклоняется полосовым фильтром. ( b ) Нити ДНК, использованные в экспериментах: стыковочные (черные), донорные (синие) и акцепторные (красные) цепи. Длину донорной цепи контролировали путем усечения 5'-конца донорной цепи. Акцепторные и донорные флуорофоры помечены в обозначенных позициях. ( c-f ) Время диссоциации донорных цепей длиной 9 нуклеотидов ( c ), 8 нуклеотидов ( d ), 7 нуклеотидов ( e ) и 6 нуклеотидов ( f ). На левых панелях показаны характерные временные диаграммы FRET, в которых высокое и низкое состояния FRET соответствуют связанным и несвязанным состояниям, соответственно.Правые панели показывают гистограммы времен диссоциации. Время диссоциации было получено путем аппроксимации гистограмм экспоненциальной функцией затухания: 670 мс (9 нт), 63 мс (8 нт), 4,8 мс (7 нт) и 3,7 мс (6 нт). частоту кадров sCMOS-камеры, также следует увеличить частоту переключения ДНК-зондов; если диссоциация ДНК-зонда происходит медленно, то при более низких концентрациях зонда пятна одной молекулы начинают перекрываться, ограничивая общую скорость визуализации. Были определены времена диссоциации донорных цепей разной длины.Были протестированы четыре различных донорских нити (рис. 1б, синий). На рис. 1c-f показаны характерные временные кривые (слева) и гистограммы времени диссоциации донорных цепей (справа). Полученное время диссоциации составляло 670 мс (9 нт), 63 мс (8 нт), 4,8 мс (7 нт) и 3,7 мс (6 нт). Измеренные времена диссоциации донорных нитей 7 нт и 6 нт были короче времени экспозиции камеры (5 мс) и должны считаться неточными. Мы выбрали донорные нити длиной 7 нт для частоты кадров 100 или 200 Гц, используемых в данной работе.Auer et al. ранее использовали донорные нити длиной 7 нт [11], но время диссоциации нити было намного больше (88 мс), чем у нас (4,8 мс).

Улучшенное отношение сигнал / шум (SNR)

Фоновый шум, исходящий от плавающих донорных и акцепторных нитей, ограничивает максимальную концентрацию зонда, которую можно использовать. Чтобы уменьшить фоновый шум и, как результат, увеличить максимальную концентрацию зонда для получения разумного отношения сигнал / шум (SNR), мы сначала попробовали разные пары донор-акцептор, кроме Alexa Fluor 488 (AF488, Invitrogen) -Cy5 (GE Healthcare) пара, использованная в предыдущей работе.Что касается фонового шума, чем больше спектральное разделение излучения донора и акцептора, тем лучше отношение сигнал / шум. Было проведено сравнение спектров поглощения и возбуждения красителей Alexa [12], Atto dyes [13, 14], красителей CF [15] и Cy [12], и в качестве кандидатов на замену были выбраны CF488A (Biotium) и CF660R (Biotium). AF488 и Cy5 соответственно. На рис. 2а сравниваются спектры возбуждения (пунктирные линии) и излучения (сплошные линии) AF488 (черный), CF488A (красный), Cy5 (пурпурный) и CF660R (фиолетовый). Спектры поглощения и излучения CF488A смещены в синий цвет по сравнению со спектрами AF488, тогда как их коэффициенты экстинкции аналогичны на пиках.С другой стороны, спектр излучения CF660R смещен в красную область по сравнению со спектром излучения Cy5. В качестве дополнительных усилий по улучшению отношения сигнал / шум мы также заменили длиннопроходный фильтр 640 нм (зеленая пунктирная линия) на полосовой фильтр 700/75 (зеленая сплошная линия). Поскольку полосовой фильтр имеет длину волны отсечки с красным смещением, чем длиннопроходный фильтр, некоторая часть сигнала акцептора теряется при замене, но мы ожидали, что уменьшение просачивания донора приведет к увеличению отношения сигнал / шум при высоком уровне донорной цепи. концентрации. Как и ожидалось, исходя из того факта, что CF488A имеет больший коэффициент экстинкции, чем AF488 при 473 нм, пара CF488A-Cy5 дала больше фотонов, чем пара AF488-Cy5 при той же мощности возбуждения (рис.2б). Фоновый шум и, следовательно, отношение сигнал / шум были значительно улучшены за счет использования полосового фильтра вместо длиннопроходного. Фоновый шум и отношение сигнал / шум также были улучшены с парой CF488A-Cy5, чем с парой AF488-Cy5 (рис. 2c, d). Примечательно, что упомянутый выше процесс оптимизации практически полностью устранил донорское просачивание, и в результате зависимость отношения сигнал / шум от концентрации донора была очень слабой (рис. 2d). Вопреки нашим ожиданиям, мы обнаружили, что замена Cy5 на CF660R не улучшила SNR, потому что CF660R имеет более высокое прямое возбуждение, чем Cy5 на длине волны 473 нм (дополнительный файл 1: рисунок S1).Поскольку CF660R имеет более низкое прямое возбуждение, чем Cy5 на 488 нм, мы ожидаем, что CF660R может обеспечить лучшую производительность, если мы будем использовать лазер возбуждения 488 нм вместо лазера 473 нм в будущей работе. В этой работе мы использовали исключительно пару CF488A-Cy5 при возбуждении 473 нм.

Рис. 2

| Улучшенное отношение сигнал / шум (SNR). ( a ) Спектры возбуждения (штриховые линии) и излучения (сплошные линии) донорного (AF488, черный; CF488A, красный) и акцепторного (Cy5, пурпурный; CF660R, фиолетовый) флуорофоров.Вертикальная синяя пунктирная линия указывает длину волны возбуждения 473 нм, вертикальная зеленая пунктирная линия указывает длину волны отсечки длиннопроходного фильтра 640 нм, а зеленая сплошная линия указывает кривую пропускания полосового фильтра 700/75 м. ( b ) Сигнал приемника пар AF488-Cy5 (черный) и CF488A-Cy5 (красный) при мощности возбуждения 1,5 кВт / см 2 , зарегистрированный камерой sCMOS и полосовым фильтром. Сигнал приемника пары AF488-Cy5 (синий) при мощности возбуждения 460 Вт / см 2 , зарегистрированный камерой EMCCD и длиннопроходным фильтром.Сигнал определяется как амплитуда двумерной гауссовой функции каждого пятна одной молекулы. Белые квадраты обозначают измеренные значения, а сплошные линии обозначают подогнанные кривые с функцией Гаусса. Пара CF488A-Cy5 дает более высокую интенсивность. ( c ) Фоновый шум пар AF488-Cy5 (черный) и CF488A-Cy5 (красный) при мощности возбуждения 1,5 кВт / см 2 с камерой sCMOS и полосовым фильтром. Фоновый шум пары AF488-Cy5 (синий) при мощности возбуждения 460 Вт / см 2 с камерой EMCCD и длиннопроходным фильтром.Фоновый шум определяется как FWHM гауссовой функции фонового сигнала. Белые квадраты обозначают измеренные значения, а сплошные линии обозначают подогнанные кривые с квадратным корнем из концентрации донорной цепи. Полосовой фильтр значительно снижает фоновый шум, а пара CF488A-Cy5 дает более низкий фоновый шум, чем пара AF488-Cy5. Горизонтальная зеленая пунктирная линия указывает фоновый шум без донорных и акцепторных цепей, который в основном вызван автофлуоресценцией, исходящей из покровного стекла.( d ) SNR пар AF488-Cy5 (черный) и CF488A-Cy5 (красный) при 1,5 кВт / см 2 Мощность возбуждения , записанная камерой sCMOS и полосовым фильтром, а также AF488-Cy5 пара (синяя) при мощности возбуждения 460 Вт / см 2 , записанная камерой EMCCD и длиннопроходным фильтром. SNR определяется как отношение сигнала к фоновому шуму. Белые квадраты обозначают рассчитанные значения, а сплошные линии обозначают подогнанные кривые с функцией, обратной квадратному корню от концентрации донорной цепи.Пара CF488A-Cy5 с камерой sCMOS и полосовым фильтром дает наивысшее SNR при высокой концентрации донорных цепей

Характеристика скорости визуализации нового микроскопа

Чтобы охарактеризовать улучшенную скорость визуализации нового микроскопа, мы сравнили скорость визуализации нового микроскопа FRET-PAINT по сравнению с предыдущим. В качестве модельной системы были отображены микротрубочки клеток COS-7. Для нового микроскопа использовались донорные нити 7 нт и мощность возбуждения 1,5 кВт / см 2 , тогда как для старого микроскопа использовались нити донора 9 нт и мощность возбуждения 460 Вт / см 2 .На рис. 3а показано изображение сверхвысокого разрешения, полученное на старом микроскопе с частотой кадров 10 Гц и временем сбора данных 1 мин. Для визуализации использовали 30 нМ меченных AF488 донорных цепей и 20 нМ меченных Cy5 акцепторных цепей. На рис. 3b и c показаны изображения сверхвысокого разрешения, полученные с помощью нового микроскопа с частотой кадров 100 Гц для рис. 3b или 200 Гц для рис. 3c. Для визуализации общее время сбора данных составляло 1 мин, и использовали 300 нМ меченных CF488A донорных цепей и 300 нМ меченных Cy5 акцепторных цепей.Как видно из рисунков, новый микроскоп давал изображения более высокого качества, чем предыдущая установка FRET-PAINT, за более короткое время. Ширина поперечного сечения микротрубочек была подобна ранее сообщенному значению (дополнительный файл 1: Рисунок S2) [11]. Чтобы показать улучшенное качество изображения более подробно, покадровые изображения областей, выделенных рамкой на фиг. 3a-c, также показаны на фиг. 3d-f соответственно. Чтобы количественно сравнить качество изображения на рис. 3a-c, мы сравнили разрешения изображения в зависимости от времени получения изображения (рис.3г). Разрешение было получено методом корреляции колец Фурье [16, 17]. Примечательно, что разрешение достигло предела (42 нм для 100 Гц, 46 нм для 200 Гц) через 20–30 с с новой установкой FRET-PAINT, тогда как разрешение все еще снижается даже через 60 с с предыдущей FRET-PAINT. настраивать. В принципе, разрешение, определяемое методом кольцевой корреляции Фурье, зависит как от точности локализации, так и от плотности локализации [16,17,18,19]. Плотность локализации линейно пропорциональна времени визуализации (рис.3h), тогда как точность локализации не зависит от времени. Таким образом, мы можем сделать вывод, что для времени визуализации в течение десятков секунд разрешение изображения определяется точностью локализации в новом микроскопе. С другой стороны, для того же времени получения изображения разрешение изображения определяется плотностью локализации в старом микроскопе. Плотность локализации как функция времени визуализации на рис. 3h дает еще один способ сравнить скорость визуализации микроскопов. Скорость локализации увеличена на 5.4 раза для изображения 100 Гц и 8 раз для изображения 200 Гц.

Рис. 3

| Характеристика скорости изображения нового микроскопа. В качестве модельной системы использовались изображения микротрубочек со сверхвысоким разрешением фиксированных клеток COS-7. ( a ) Изображение было восстановлено из 600 кадров, записанных с частотой кадров 10 Гц с помощью предыдущего микроскопа (камера EMCCD, фильтр длинного прохода, 460 Вт / см 2 мощность возбуждения, 30 нМ 9 нт AF488 донорные цепи, 20 нМ 10 нМ акцепторных цепей Cy5).( b , c ) Изображения были восстановлены из 6000 кадров, записанных с частотой кадров 100 Гц ( b ) или 12 000 кадров, записанных с частотой кадров 200 Гц ( c ) с новым микроскопом ( камера sCMOS, полосовой фильтр, мощность возбуждения 460 Вт / см ( 2 ), 300 нМ 7 нМ донорных цепей CF488A, 300 нМ 9 нМ акцепторных цепей Cy5). Буфер для визуализации (10 мМ Трис-HCl, pH 8,0, 500 мМ NaCl, 1 мг / мл глюкозооксидазы, 5 мг / мл глюкозы, 0,04 мг / мл каталазы и 1 мМ Trolox) использовали для всей визуализации.Все изображения были восстановлены с помощью ThunderSTORM [23] с методом максимального правдоподобия. Общее время визуализации для всех изображений составляет 60 с. ( d - f ) Цейтраферные изображения областей в рамке в a - c в указанное время формирования изображения. ( g ) Разрешение изображения a - c с использованием метода кольцевой корреляции Фурье в зависимости от времени визуализации. Белые квадраты обозначают измеренное значение, а сплошные линии обозначают подогнанные кривые с функцией экспоненциального затухания.( h ) Плотность локализации как функция времени визуализации (100 Гц, черный; 200 Гц, красный; 10 Гц, синий). Плотность локализации определяется как количество событий локализации на 1 мкм 2 . Чтобы свести к минимуму влияние интересующей области, выбранной для анализа данных, плотность локализации была рассчитана из 10 различных областей 5 разных ячеек. Прямоугольники в квадрате указывают на среднее значение, а полосы ошибок указывают на стандартное отклонение. Скорость увеличения плотности локализации составила 21 (10 Гц), 114 (100 Гц) и 168 (200 Гц) локализации / мкм 2 / с.Мы получили увеличение в 5,4 раза для изображения 100 Гц и в 8 раз увеличение для изображения 200 Гц по сравнению со старым микроскопом. Масштабные планки: 5 мкм ( a - c ), 1 мкм ( d - f )

Тайлер Грант Уроки игры на гитаре | Курсы в JamPlay

Тайлер Грант привносит в JamPlay свой опыт в сборке плоских карт!

Тайлер занял первое место на гитарном конкурсе Rockygrass в 2003 году, фестивальном конкурсе Уэйна Хендерсона в 2005 году, чемпионате Новой Англии 2008 года по гитаре, чемпионате Doc Watson на гитаре в Мерлефесте в 2009 году и стал национальным чемпионом по сбору кубиков, заняв первое место на Winfield в 2008 году. .Он был инструктором в CalArts, Acoustic Kamp Стива Кауфмана, Rockygrass Academy, Augusta Heritage Centre Bluegrass Week и Grand Targhee Music Camp. Он был показан в журналах Acoustic Guitar Magazine, Flatpicking Guitar Magazine и Fingerstyle Guitar Magazine. Он живет в Лионе, штат Колорадо, где пишет музыку, любит проводить время на природе, преподает уроки и записывает для Grant Central Records. Тайлер Грант является национальным чемпионом по сбору самолетов и всемирно признанным гитаристом-виртуозом, автором песен, вокалистом, продюсером и лидером группы Grant Farm®.Тайлер выступал на большинстве крупных фестивалей США и дал тысячи концертов и гитарных мастер-классов по всему миру. Он выпустил четыре сольных альбома и четыре релиза Grant Farm для своей собственной Grant Central Records. Последний релиз 2016 года, Earth and Wood, триумфальное возвращение в Bluegrass, является первым акустическим альбомом Тайлера после получившего признание Up The Neck шесть лет назад. В 2016 году Grant Farm выпустили свое самое амбициозное начинание, Kiss The Ground, концептуальный альбом для трудящихся, который дебютировал на пятом месте в чартах Relix / JamBand Radio.

Тайлер окончил Калифорнийский институт искусств (CalArts) в 2000 году со степенью бакалавра в области игры на гитаре. С 2005 по 2010 год Тайлер сотни раз появлялся по всей стране в составе групп Дрю Эммитта и Эммитта-Нерши, в которых участвовали фронтмены двух самых популярных в мире джем-бэндов: Leftover Salmon и String Cheese Incident. .

Тайлер занял первое место на конкурсе гитаристов Rockygrass в 2003 году, фестивальном конкурсе Уэйна Хендерсона в 2005 году, чемпионате Новой Англии 2008 года по игре на гитаре, чемпионате Doc Watson в 2009 году на Мерлефесте и стал национальным чемпионом по сбору кубиков, заняв первое место на Winfield в 2008 г.Он был инструктором в CalArts, Steve Kaufman's Acoustic Kamp, Rockygrass Academy, Augusta Heritage Centre Bluegrass Week, Grand Targhee Music Camp, а недавно завершил серию уроков Flatpicking для чрезвычайно успешного JamPlay.com. Он был показан в журналах Acoustic Guitar Magazine, Flatpicking Guitar Magazine и Fingerstyle Guitar Magazine.

Он живет в Форт-Коллинз, Колорадо, где он пишет музыку, любит проводить время на свежем воздухе, преподает, записывает для Grant Central Records и поддерживает семейную жизнь, несмотря на плотный график гастролей и выступлений.

Расширенная нормализация FRET позволяет проводить количественный анализ белковых взаимодействий, включая стехиометрию и относительное сродство в живых клетках

% PDF-1.4 % 1 0 объект > эндобдж 2 0 obj > поток application / pdfdoi: 10.1038 / s41598-019-44650-0

  • Springer US
  • Научные отчеты, DOI: 10.1038 / s41598-019-44650-0
  • Расширенная нормализация FRET позволяет проводить количественный анализ белковых взаимодействий, включая стехиометрию и относительное сродство в живых клетках.
  • 10.Научные отчеты © 2019, Автор (ы) 2045-232210.1038 / s41598-019-44650-0Springer2019-05- 28T17: 49: 56 + 02: 002019-05-28T14: 17: 07 + 05: 302019-05-28T17: 49: 56 + 02: 00TrueiText® 5.3.5 © 2000-2012 1T3XT BVBA (версия AGPL) VoRuuid: 52607102-2181-4808-ac10-9dd975f8b602uuid: a83e6b48-ce25-4fe9-b542-afb0632253dbdefault1
  • converteduid: 75b8fa03-b2f2-4133-91fc-6e8d2163cdf155: A83e6d2163cdb2: PDF 2B
  • http: // ns.adobe.com/pdf/1.3/pdf Adobe PDF Schema
  • internal Объект имени, указывающий, был ли документ изменен для включения информации о треппинге TrappedText
  • http://ns.adobe.com/pdfx/1.3/pdfxpdfx
  • внутренний идентификатор стандарта PDF / X GTS_PDFXVersionText
  • внутренний Уровень соответствия стандарту PDF / X GTS_PDFXConformanceText
  • internal Компания, создающая PDFCompanyText
  • internal Дата последнего изменения документа SourceModifiedText
  • Внутренние зеркала Крест: DOIdoiText
  • http: // ns.adobe.com/xap/1.0/mm/xmpMMXMP Media Management Schema
  • Внутренний идентификатор на основе UUID для конкретного воплощения документа InstanceIDURI
  • внутренний - Общий идентификатор для всех версий и представлений документа.
  • http://www.aiim.org/pdfa/ns/id/pdfaidPDF/A ID Schema
  • internalPart of PDF / A standardpartInteger
  • внутренняя Поправка к стандарту PDF / A amdText
  • внутренний Уровень соответствия стандарту PDF / A Текст
  • http: // prismstandard.org / namespaces / basic / 2.0 / prismPrism
  • external Тип агрегирования определяет единицу агрегирования для коллекции контента. Комментарий PRISM рекомендует использовать словарь с контролируемым типом агрегирования PRISM для предоставления значений для этого элемента. Примечание: PRISM не рекомендует использовать значение #other, разрешенное в настоящее время в этом контролируемом словаре. Вместо использования #other обратитесь к группе PRISM по адресу [email protected], чтобы запросить добавление вашего термина в словарь с контролируемым типом агрегирования.aggregationTypeText
  • externalCopyright copyrightText
  • external - цифровой идентификатор объекта для статьи. DOI также может использоваться как идентификатор dc :. Если используется в качестве идентификатора dc: identifier, форма URI должна быть захвачена, а пустой идентификатор также должен быть захвачен с помощью prism: doi. Если в качестве обязательного идентификатора dc: identifier используется альтернативный уникальный идентификатор, то DOI должен быть указан как чистый идентификатор только в пределах prism: doi.Если URL-адрес, связанный с DOI, должен быть указан, тогда prism: url может использоваться вместе с prism: doi для предоставления конечной точки службы (то есть URL-адреса). doiText
  • externalISSN для электронной версии проблемы, в которой встречается ресурс. Разрешает издателям включать второй ISSN, идентифицирующий электронную версию проблемы, в которой встречается ресурс (следовательно, e (lectronic) Issn. Если используется, prism: eIssn ДОЛЖЕН содержать ISSN электронной версии.См. Призму: исн. issnText
  • external Название журнала или другого издания, в котором был / будет опубликован ресурс. Обычно это используется для предоставления названия журнала, в котором появилась статья, в качестве метаданных для статьи, а также такой информации, как название статьи, издатель, том, номер и дата обложки. Примечание. Название публикации можно использовать для различения печатного журнала и онлайн-версии, если названия разные, например, «журнал» и «журнал».com. " PublicationNameText
  • externalЭтот элемент предоставляет URL-адрес статьи или единицы контента. Платформа атрибутов необязательно разрешена для ситуаций, в которых необходимо указать несколько URL-адресов. PRISM рекомендует использовать вместе с этим элементом подмножество значений платформы PCV, а именно «мобильный» и «Интернет». ПРИМЕЧАНИЕ. PRISM не рекомендует использовать значение #other, разрешенное в управляемом словаре платформы PRISM. Вместо использования #other обратитесь к группе PRISM по адресу prism-wg @ yahoogroups.com, чтобы запросить добавление вашего термина в словарь, контролируемый платформой. urlText
  • http://www.niso.org/schemas/jav/1.0/javNISO
  • external Значения для версии статьи журнала могут быть одним из следующих: AO = Авторский оригинал SMUR = Представленная рукопись на рассмотрении AM = принятая рукопись P = Доказательство VoR = версия записи CVoR = Исправленная версия записи EVoR = Расширенная версия Recordjournal_article_versionClosed Выбор текста
  • конечный поток эндобдж 3 0 obj > эндобдж 8 0 объект [9 0 R 10 0 R 11 0 R 12 0 R 13 0 R 14 0 R 15 0 R 16 0 R 17 0 R 18 0 R 19 0 R] эндобдж 9 0 объект > / A 20 0 R / Rect [222.

    Добавить комментарий

    Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *