ООО «Центр Грузовой Техники»

8(812)244-68-92

Содержание

Двухсистемные замки (комбинированные ) для металлических дверей Неман

Наиболее эффективной комбинацией в настоящее время по праву считается сувальдно-цилиндрическая. Также присутствуют многофункциональные замки, где одна из частей использует электронный ключ.

Двухсистемный замок – многофункциональный замок, который успешно объединяет возможности двух систем в одном корпусе.

Основными преимуществами такого решения становятся:

  • Экономичность - приобретение и монтаж многофункционального замка обойдётся покупателю дешевле, нежели приобретение и установку двух отдельных замков разного типа;
  • Высокий уровень безопасности - двухсистемный замок позволяет создать более эффективную, сложную и взломостойкую систему запирания.

Любой многофункциональный замок на железную дверь – это 3 группы замков, различающихся по принципу действия:

  • Зависимые замки – модели, предлагающие максимальный уровень безопасности. Дополнительная часть замка не может быть заперта, если открыта основная часть. Данный многофункциональный замок может быть закрыт на основной механизм или основной и дополнительный. Невозможно запирание только на дополнительный механизм.
  • Независимые замки. Механизмы замка не зависят друг от друга. Использование подобной системы мало чем отличается от работы двух раздельных замков. Уровень удобства и безопасности не отличается от использования двух простых замков.
  • Полузависимые замки. Модели замков предлагают возможность запирания не зависимо от состояния второго механизма. Здесь одна из частей способна блокировать другую. Так, замок запирается на оба механизма (полностью) либо на один из них (частично). В случае полного запирания/отпирания замка должна соблюдаться определённая последовательность действий. Например, сначала запирается блокирующий механизм, а после – основной.

Зависимые и полузависимые модели многофункциональных замков – популярные предложения, которые гарантируют высокую безопасность и экономию средств.

Двухсистемные замки MOTTURA 54-й серии

Двухсистемные замки Mottura 54-й серии

В данной серии представлены замки, совмещающие в себе два механизма - сувальдный и цилиндровый.

Это удобно с точки зрения монтажа и дешевле обходится по сравнению с двумя раздельными замками...

В данной серии представлены замки, совмещающие в себе два механизма - сувальдный и цилиндровый. Это удобно с точки зрения монтажа и дешевле обходится по сравнению с двумя раздельными замками. Двухсистемные замки бывают с разной степенью зависимости составляющих механизмов (об этом подробнее ниже).

Двухсистемные замки Mottura у нас представлены в варианте, когда основной частью является сувальдная, а цилиндровая часть - дополнительная. Часть замков имеет систему перекодировки на новые ключи и защиту от свободного копирования, плюс оригинальную систему противодействия отмычке совмещенную с блокировкой ригелей. Другие замки имеют более простое исполнение, но зато они дешевле.

Двухсистемные замки MOTTURA могут быть только "нижними" (с защелкой и соответственно ручкой), то есть они служат и для запирания, и для фиксации двери с помощью защелки. Защелка убирается ключом или ручкой. Все замки с вертикальным запиранием и представлены во "вкладном" варианте, то есть без лицевой планки.


Двухсистемный замок
Mottura 54.YM.919.B

НОВИНКА
Лучший замок в ассортименте компании СТАЛ!

MOTTURA 54 YM 919 B / 37 - полузависимый замок с системой быстрой перекодировки, блокировкой от забивания и блокирующей шторкой.


Ключи: один монтажный + пять постоянных с системой "MyKey".

В 2009 году, компания Mottura выпустила новую серию замков со сменными сердечниками. Но базе одного корпуса возможна сборка замков с различной функциональностью. В нашем ассортименте представлены два варианта: с перекодировкой и без. Тут описан замок с перекодировкой, а описание другой модели смотрите ниже.

Отличительной особенностью данного замка, является наличие перекодировки (буква "Y"), защищенных ключей (буква "M"), защиты от забивания ригелей (буква "B" в индексе), наличие блокирующей твердосплавной шторки, плавный привод на цилиндровой части.

Прочитать в отдельном окне: подробности о новинках Mottura: перекодировка, защита ключей, защита от забивания.

Полное запирание: 4 полуоборота по 180° на сувальдной части, вылет ригелей 36 мм, 2 оборота по 360° на цилиндровой, вылет 22 мм, диаметр ригелей 18 мм. Вылет тяг - 20 мм. Три ригеля у сувальдной части + один ригель у цилиндровой + защелка.

В качестве рекомендации, предлагается установка цилиндра с вертушкой изнутри - получится аналог задвижки для быстрого и удобного запирания изнутри.


Обратите внимание, что в отличие от других замков 54.9... серии, именно замок 54.YM.919B/37 представленный в ассортименте СТАЛ, имеет полный набор описанных выше функций. Это наиболее полная, наиболее сбалансированная и максимально защищенная версия. Это топовая модель - жемчужина в линейке замков Mottura. Другие замки в этой серии (независимые, полностью зависимые, без шторок, без блокировки ригелей) - компромисс.



Ближайшие распространенные аналоги и упрощенные варианты:
MOTTURA 54. ..93... - врезные (c планкой) варианты.
MOTTURA 54...915, 54...916 - зависимый и независимый без шторки.
MOTTURA 54...917

- зависимый с с накидной скобой на цилиндровой части.
MOTTURA 54...918 - зависимый со шторкой.
Замки без буквы B - отсутствует защита от забивания ригелей.
Замки без буквы Y - отсутствует перекодировка.
Замки без буквы M - отсутствет защита ключей от копирования.
Версия / 28 - четырехригельный вариант.

Для любителей технических подробностей: описание деталировки и устройства замка на базе корпуса 54.W.919



Двухсистемный замок
Mottura 54.K.919.B

MOTTURA 54 K 919 B / 37 - полузависимый замок с блокировкой от забивания и шторкой.


Ключи: пять постоянных.

Корпус этого замка полностью аналогичен описанному выше, но сердечник (нуклео) не предусматривает перекодировку и защиту ключей от копирования. Функция блокировки ригелей, шторка и плавный привод на цилиндровой части сохраняются. По сути, данный замок можно рассматривать как обычный двухсистемный типа 54.597

Отличительной особенностью данного замка, является наличие защиты от забивания ригелей (буква "B" в индексе), наличие блокирующей твердосплавной шторки, плавный привод на цилиндровой части.

Прочитать в отдельном окне: подробности о новинках Mottura: защита от забивания.

Полное запирание: 4 полуоборота по 180° на сувальдной части, вылет ригелей 36 мм, 2 оборота по 360° на цилиндровой, вылет 22 мм, диаметр ригелей 18 мм. Вылет тяг - 20 мм. Три ригеля у сувальдной части + один ригель у цилиндровой + защелка.

В качестве рекомендации, предлагается установка цилиндра с вертушкой изнутри - получится аналог задвижки для быстрого и удобного запирания изнутри.


Ближайшие распространенные аналоги и упрощенные варианты:
MOTTURA 54...93... - врезные (c планкой) варианты.
MOTTURA 54...915, 54...916 - зависимый и независимый без шторки.
MOTTURA 54. ..917 - зависимый с с накидной скобой на цилиндровой части.
MOTTURA 54...918 - зависимый со шторкой.
Замки без буквы B - отсутствует защита от забивания ригелей.
Версия / 28 - четырехригельный вариант.




Замки могут комплектоваться любыми цилиндровыми механизмами европейского профиля.
Рекомендуется установка сложных цилиндровых механизмов и врезных защит цилиндров, а также бронированных защит (пластин), на сувальдную часть.

Еще ряд двухсистемных замков MOTTURA, которые у нас не представлены, мы просто перечислим:
MOTTURA 54574, 54774 - Вкладной и врезной варианты, у второй сувальдной части пять ригелей
MOTTURA 54593, 54793 - Вкладной и врезной варианты, с двумя сувальдными частями и опцией под накидную скобу.
MOTTURA 54577, 54777 - Вкладной и врезной варианты, с накидной скобой с приводом от ручки.
MOTTURA 54594, 54595, 54589, 54794, 54795, 54789 - Вкладной и врезной варианты, зависимые и независимые, с двумя сувальдными частями.
MOTTURA 85574, 85588, 85589, 85595, 85774, 85788, 85789, 85795 - Вкладной и врезной варианты, зависимые и независимые, с опциями, с двумя цилиндровыми частями.



ООО «БАРС-Х». Сервис. Ремонт дверей, замена замков

Фирма ООО «Барс-Х» - лицензированная, сертифицированная сервисная служба!

Вас приветствует фирма, компания ООО "Барс-Х" созданная в 1996 году для оказания помощи населению! Официально зарегистрированная в 1998 году! Последняя дата перерегистрации 14 августа 2009 г. ОГРН 1097746448304. Ремонтное подразделение быстрого реагирования: Замена замков, установка, врезка и ремонт, доставка механизмов замков. Сервис по замкам и дверям осуществляется ежедневно и без выходных с выездом мастера с замками на выбор в кратчайшее время. Любую услугу выполним Быстро - Качественно - Надежно! С нами Ваша безопасность в надежных руках!

Барс-Х Лицензированная, Сертифицированная московская сервисная служба замков и дверей!

(Лицензия МЧС России выданная Главным управлением министерства российской федерации по делам гражданской обороны, чрезвычайным ситуациям и ликвидации последствий стихийных бедствий по городу Москве – №38-2/00961 на выполнение работ по монтажу, ремонту и обслуживанию зданий, изделий и конструкций, не только дверных блоков, но и сигнализаций….

) БАРС-Х – это крупная организация по оказанию услуг в сфере быта по ремонту дверей, замене, установке замков, надежных замков, систем контроля доступа в помещение, видеонаблюдения, защите замков, полного или частичного «апгрейда» металлической – стальной двери и замков. Имеем многолетней опыт в оказании услуг. Мы знаем, что Вам предложить!

Мы имеем прямые контакты практически со всеми поставщиками замков и отделочных материалов двери! А это значит что мы в курсе всех новинок, знаем их слабые и сильные стороны замков. Мы работаем только с сертифицированной проверенной продукцией, «оригинальными» механизмами (замками) как отечественного, так и импортного производства.

С нами Вы можете быть спокойны за оригинальность продукции! У нас есть практически все замки и модели как импортного EVVA, Mottura, Cisa, Atra-Dierre, Kaba, Kaba-Mauer, Abus, DOM, Abloy, Mul-t-lock, Super-Lock, Gerda, Securemme и многих других лидирующих производителей, так и отечественных фирм, для входных дверей металлических, железных, стальных, бронированных.

Мы знаем ассортимент замков в магазинах и на рынках Москвы огромен. Мы поможем разобраться. Аргументировано предложим варианты. Квалифицированно осмотрим конструкцию двери и грамотно подберем оптимальную комплектацию замков, отвечающую Вашим требованиям безопасности.

У нас самый большой выбор декоративных панелей для эстетического вида, Вашей двери! Только у нас специалисты широкого профиля знающие и любящие свою работу!

Мы предложим весь ассортимент отделки двери: винил кожа, шпон, ламинат, пластик, постформинг, массив, корабельная фанера (авиационная фанера)… Варианты цветовой гаммы и рисунков удивят даже изысканного заказчика! У нас есть все!

Мы предоставим полную документацию на заменяемые замки! Вся наша продукция сертифицирована.

Мы гарантируем разумные цены на работы и устанавливаемые механизмы разрешенные правом торговли законами РФ! Работы производятся по наличному и безналичному расчету, за нал или безнал - решать вам!

Мы гарантируем качественную работу

, если это не правда – Мы вернем Вам деньги! Обладая знаниями, всей необходимой документацией и оригинальными комплектующими мы квалифицированно выполним поставленную перед нами задачу.

Мы можем гарантировать честность и порядочность! Мы в курсе новинок поставляющих в Россию! И Мы не побоимся сказать Мы профессионалы!

Мы уверены! Вы, останетесь довольны! С помощью наших мастеров - специалистов ваш дом или офис станет неприступной крепостью. У нас работают только москвичи, высококвалифицированные мастера, дипломированный руководящий состав, отлично знающие свое дело, которые быстро, легко, без потери времени и качества могут выполнить любые работы, связанные с замками и дверьми, а также оказать услуги по консультации практически в любых вопросах, касающихся врезке замены замка, ремонта двери. Ассортимент предлагаемых нами услуг постоянно расширяется, чтобы удовлетворить требования самых изысканных заказчиков, знающих толк в замках, надежных замках, взломостойких замках, кто действительно хочет защитить свой дом от взлома, кражи.

Главный принцип работы компании Барс-Х: максимально качественный сервис и индивидуальный подход к каждому клиенту! Мы с радостью можем предложить все услуги и конечно же подберем для Вас как механические замки, так и системы контроля доступа в помещение (скрытые - замки, видеонаблюдение, биометрические замки, электронные замки…). В нашу пользу говорит «время», опыт работы, довольные клиенты. Мы сделаем все возможное, чтобы у вас остались только приятные впечатления! А Ваши замки стали по настоящему надежными, работоспособными и эстетичными!

Доверьте профессионалам установку и подбор замков (механических, электронных ) на входную дверь, квартирную, офисную – это инвестиция в безопасность, и спокойствие семьи, спокойствие за своих близких и родных. А еще сэкономить и получить скидку! Разве это не приятно?

МЫ ВСЕГДА С ВАМИ, МЫ РЯДОМ! ЗАМОК, ДВЕРЬ ТРЕВОЖИТ БАРС-Х ПОМОЖЕТ!

ФОТО НЕКОТОРЫХ НАШИХ РАБОТ:

19.06.2019 Рейтинг замков на входную металлическую дверь

  1. Главная
  2. Блог
  3. Рейтинг замков на входную металлическую дверь

Сохранность вашего имущества, а также личная безопасность напрямую зависят от замка, который вы установите на входную дверь.

Замочная скважина с хитрым устройством препятствует взлому и открыванию отмычками. Замки классифицируют по уровню секретности: им присваивают значение 1–4 класса — от элементарных, вскрываемых за 5 минут, до усложненных, на взлом которых даже у опытного «домушника» уйдет не меньше получаса.

Человеку, не посвященному в тонкости производства, сложно выбрать подходящий тип защиты. В статье кратко разберем основные виды и особенности замочных механизмов.

Основные виды

В зависимости от типа двери и необходимой степени защиты, вам подойдет один из этих замков:

  • Сувальдный. Секретная часть представлена набором пластин с фигурным краем. Для его открытия фигурные выступы подталкиваются соответствующими выступами на бородке ключа. Различают навесные, накладные и врезные устройства. Обладают возможностью перекодировки, что удобно в случае потери ключа. Надежность зависит от количества пластин — чем их больше, тем выше уровень защиты.
  • Цилиндровый. Ключевым механизмом является цилиндр — так называемая «личинка», которая провернется в корпусе только тогда, когда в нее вставлен подходящий ключ. Степень защиты зависит от расположения и количества штифтов в личинке: например, штифтовый однорядный механизм довольно легко взломать, а вот изделие с поворотными штифтами — значительно сложнее.
  • Комбинированный. Заслуженно считается самым безопасным и надежным. Устройство замка может включать несколько одинаковых или разноплановых механизмов. По типу взаимодействия систем друг с другом выделяют независимые, полузависимые и зависимые устройства. К примеру, двухсистемное изделие, части которого зависят друг от друга, необходимо открывать в определенном порядке — не открыв основной механизм, вы не получите доступ к дополнительному.

Если двери не нужна основательная защита, можно установить обычный ригельный замок, стержни которого выталкиваются поворотным устройством. На входную группу чаще устанавливают сувальдные, цилиндровые или комбинированные механизмы. Для дополнительной защиты установите защелку — миниатюрный засов, выдвигаемый на ночь, когда все «свои» — дома.

Выбирая замочный механизм, опирайтесь на следующие рекомендации:

  • Цена — не всегда показатель эффективности и надежности. Среди вариантов средней ценовой категории можно найти экземпляры с подходящими параметрами.
  • Выбирайте замок в зависимости от двери — материала, из которого она изготовлена, от размеров и массивности. Например, тяжелый механический замок не подойдет для деревянной двери. Это не только не обеспечит необходимой защиты, но и облегчит злоумышленникам взлом.
  • На входную дверь рекомендуется устанавливать замки не ниже 3–4 класса безопасности.
  • Покупая новый комплект, обязательно сопоставьте фактическое количество ключей с указанным в эксплуатационном пособии.

Подходите к выбору замка с умом — правильный выбор обеспечит надежную защиту имущества и вашу личную безопасность.

Поделиться в соцсетях


Самые надежные виды замков для входных дверей | Статьи

Идеальный дверной замок не только обеспечивает безопасность, но и обладает такими качествами, как долговечность, простота в использовании, надежность. Хороший механизм может стоить дороже, чем сама дверь, особенно это заметно на примере продукции иностранного производства. Часто дешевые замки китайского производства изготавливаются по устаревшим технологиям, содержат хрупкие и недолговечные элементы из силумина или пластмассы.

Помимо материалов, использованных для производства, и страны-изготовителя, других общих параметров, важнейшими критериями при выборе замка, являются:

1. Степень секретности. Универсальный критерий, который подразумевает такие показатели, как количество комбинаций, степень устойчивости к механическим повреждениям и длительность эксплуатации, защищенность от взлома отмычкой, вероятность совпадения ключей. Соответственно, выделяют низкий, средний и высокий степень секретности.

2. Класс устойчивости ко взлому. Определяется в зависимости от того, сколько времени требуется для вскрытия. Всего выделяют 4 класса, первый имеет время вскрытия менее 5-ти минут, второй – от 5 до 15, третий – свыше 15, четвертый – 30 минут и свыше.

Получить информацию об этих параметрах можно в техническом описании изделия, на сайте компании-производителя (для иностранных товаров хорошо, если есть русскоязычная версия) или у менеджера по продажам.

Типы и назначение дверных замков

Самыми распространенными и надежными являются механизмы врезного и вкладного типа, по своему функциональному предназначению они делятся на две группы: запирающего и фиксирующего-запирающего типа. Последний чаще всего устанавливается в нижней части полотна, и, среди профессионалов, именуется просто как «основной». Первая группа не обладает внутренним фиксатором, и применяется только для запирания двери. По принципу работы замки классифицируются на сувальдные, цилиндровые (простые, штифтовые, дисковые) и универсальные (комбинированные).

Цилиндровые дверные замки

Данный механизм используется уже на протяжении более полутора столетий. Его основными преимуществами являются простота работы и замены, легкость восстановления. Чтобы открыть такой замок, необходимо, при помощи ключа, выстроить внутри него определенную комбинацию из специальных элементов (пинов, щупов, блоков, шайб). Степень секретности зависит от количества этих деталей. Большой надежностью обладают механизмы с крестообразной формой замочной скважины.

Цилиндровый штифтовый замок

Одна из разновидностей цилиндровой конструкции – это штифтовый замок. Может быть рассчитан на ключ английского (обладает невысоким классом устойчивости ко взлому, поэтому, применяется для межкомнатных дверей) или перфорированного типа (в зависимости от конкретной модели класс секретности может варьироваться от 2 до 4). Последняя разновидность может дополнительно оснащаться защитными элементами – бронированными пластинами, металлическими накладками, время вскрытия составляет в таком случае более 30 минут, и сделать это бесшумно невозможно.

Цилиндровый дисковый замок

Отличительной особенностью этих механизмов является использование внутри вместо пинов подвижных дисков, которые располагаются не по высоте, а под определенным углом. Обладают высокой степенью секретности, такой замок невозможно высверлить. Значительно улучшают параметры изделия защитные пластины и накладки.

Сувальдные замки

Принцип работы подобных механизмов является изобретением многовековой давности. Часто продавцы-консультанты именуют их как «сейфовые», исходя из того, что раньше они часто устанавливались на этом виде шкафов. Внутри замка находятся подвижные пластины – сувальды (отсюда и название), которые передвигаются под действием ключа и выстраиваются в определенную комбинацию. Степень секретности зависит от количества сувальд, могут использоваться ложные пазы для отмычек.

Комбинированные замки

Самым надежным типом замка для входной двери является тот, в котором использованы несколько различных механизмов. Вскрыть его очень сложно, запирающие элементы дополняют друг друга и служат своего рода «подстраховкой». Он также обладает несколькими точками запирания и массивностью. В популярных моделях один механизм является основным, а второй дополнительным.

Многие производители совмещают в одном изделии принципы действия нескольких собственных моделей, что существенно сказывается на увеличении стоимости товара. Они могут оснащаться функцией перекодировки. Она полезна при утере одного или нескольких ключей, при подозрении, что мог быть сделан дубликат ключа посторонним человеком, во время проведения ремонта. При отъезде из дома можно перекодировать замок на один тип ключа, а по возвращении – вернуть изначальные значения.

Наиболее распространенными являются следующие типы комбинаций:

1. Цилиндровый и сувальдный замок.

2. Две системы цилиндрового типа.

3. Две системы сувальдного типа.

По функциональному критерию выделяют зависимые, полузависимые, и независимые механизмы. Соответственно, в независимой конструкции замки работают одновременно, и открывать их можно в любой последовательности. Полузависимые системы оснащены специальной металлической шторкой, которая блокирует механизм второго запора. Она также служит дополнительной защитой от попадания посторонних предметов и взлома манипуляционным методом.

Помимо защитных пластин, комбинированный замок может быть доукомплектован пиновой накладкой, врезной тягой, дополнительными цилиндрами повышенной секретности и надежности.

Выводы наших специалистов

Ассортимент дверных замков огромен, на рынке широко представлены китайские, европейские, отечественные производители. Выбрать среди них самый надежный можно по типу конструкционного устройства, по классу устойчивости ко взлому и степени секретности. Для оборудования массивных металлических дверей наиболее предпочтительно использовать комбинированный тип замка.  Несмотря на некоторое превосходство в цене, делать выбор нужно в пользу механизмов европейского или отечественного производства, так как китайская продукция отличается низким качеством, невысокой степенью надежности и недолговечностью. 

MOTTURA 54 YM 919 B / 37

Главная › Новости

Опубликовано: 08.12.2018

НОВИНКА

Лучший замок в ассортименте компании СТАЛ!

MOTTURA 54 J 919 B / 37 - полузависимый замок с системой быстрой перекодировки, блокировкой от забивания и блокирующей шторкой.

Ключи: один монтажный + пять постоянных с системой "MyKey".

В 2009 году, компания Mottura выпустила новую серию замков со сменными сердечниками. Но базе одного корпуса возможна сборка замков с различной функциональностью. В нашем ассортименте представлены два варианта: с перекодировкой и без. Тут описан замок с перекодировкой, а описание другой модели смотрите ниже.


Вскрытие Моттуры самоимпрессией.

Прочитать в отдельном окне: подробности о новинках Mottura: перекодировка, защита ключей, защита от забивания.

Полное запирание: 4 полуоборота по 180° на сувальдной части, вылет ригелей 36 мм, 2 оборота по 360° на цилиндровой, вылет 22 мм, диаметр ригелей 18 мм. Вылет тяг - 20 мм. Три ригеля у сувальдной части + один ригель у цилиндровой + защелка.

В качестве рекомендации, предлагается установка цилиндра с вертушкой изнутри - получится аналог задвижки для быстрого и удобного запирания изнутри.

Обратите внимание, что в отличие от других замков 54.9... серии, именно замок 54.J.919B/37 представленный в ассортименте СТАЛ, имеет полный набор описанных выше функций. Это наиболее полная, наиболее сбалансированная и максимально защищенная версия. Это топовая модель - жемчужина в линейке замков Mottura. Другие замки в этой серии (независимые, полностью зависимые, без шторок, без блокировки ригелей) - компромисс.

Замки могут комплектоваться любыми цилиндровыми механизмами европейского профиля. Рекомендуется установка сложных цилиндровых механизмов и врезных защит цилиндров, а также бронированных защит (пластин), на сувальдную часть.

MOTTURA — GUDOOR

Уникальная совместная разработка ООО «МЕТТЭМ-ПРОИЗВОДСТВО» и Иванова Станислава Михайловича, автора и обладателя патентов № 2387774, № 2504632.

Сувальдный замок с абсолютно новым механизмом секретности, сертифицированный в соответствии с 4, высшим классом ГОСТ.

Циклограмма работы замка такова. На первом полуобороте ключа происходит выставление сувальд в соответствии с кодом первой бородки ключа при блокированном засове. Положение сувальд запоминается, а потом жестко блокируется зубчатой гребенкой. После этого происходит перемещение засова на половину вылета. Далее происходит сброс сувальд в начальное положение, и циклограмма повторяется для второго полуоборота ключа, только теперь задействована вторая бородка ключа.

Кроме высокой стойкости к известным нам манипуляционным способам вскрытия, замок имеет необходимый набор средств против криминального взлома: закаленные вставки в одном из пальцев засова и кодовой стойке ригеля, ослабленные элементы для противодействия «свертышу», а также защитная пластина из стали 65Г, закаленная до 60 единиц по HRC (поставляется по отдельному закзау).

Оригинальный алгоритм работы исключает возможность вскрытия замка известными на сегодня манипуляционными способами.

МЕТТЭМ® Лидер был испытан специалистами ФГКУ В/ч 35533 (протокол испытаний № 98-С от 11.12.2013 г.), которые подтвердили невозможность расшифровать кодовую комбинацию замка механическими щупами и оптическими приборами, а также удостоверили, что по показателям устойчивости к неразрушающим методам вскрытия эта модель соответствует 4, самому высокому классу по ГОСТ 5089-2011.


ТЕХНИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ

класс ГОСТ (5089 2011) 4
габаритные размеры 255 х 131 мм.
количество полуоборотов 2
количество ригелей 4 шт.
диаметр ригелей 18 мм.
вылет ригелей 33 мм.
количество ключей 5 шт.
длина ключа 50 мм.

Автоблокировка Vs. Бегунки-молнии с полуавтоматическим замком для обуви

Существуют два основных типа ползунков на молнии, используемых в обувной промышленности, основанные на функционировании - автоматические или полуавтоматические (например, с фиксатором).

Ползунки с автоматической блокировкой работают с помощью механизма блокировки, который предотвращает их скольжение вверх или вниз, если язычок не натянут. Другими словами, эти ползунки могут быть закреплены на месте без нежелательного падения с цепочки молнии при использовании.

Ползунки с полуавтоматической фиксацией не будут скользить свободно и плавно, если язычок не будет поднят или приподнят до определенной степени, чтобы освободить стопорный штифт. Ползунки этого типа могут работать некорректно, а зубцы молнии могут быть повреждены во время работы.

Слайдеры для обуви

SBS изготовлены из высококачественных материалов, которые способствуют укреплению корпуса с высокой удерживающей силой фиксирующего устройства и растягивающей силой поперечной прочности, что обеспечивает защиту от неправильного зацепления и деформации.Однако на данный момент для выбора доступны только ползунки с автоблокировкой.

Помимо действующего механизма, при выборе бегунков для вашей обуви следует учитывать тип застежки-молнии [1] . Ползунки, предназначенные для одной разновидности, не должны сочетаться с другой разновидностью, несмотря на тот же механизм блокировки, в противном случае ваша обувь выйдет из строя.

[1] Металлические и нейлоновые молнии широко используются в обувной промышленности, выбор которых в основном зависит от линии обуви, а также от желаемой моды или утилитарного дизайна.Также используются пластиковые молнии. Однако они не так популярны, как их аналоги.

Связанные сообщения

  • Применение застежек-молний на кожаных изделиях и их преимущества
  • 7 самых специальных ползунков на молнии
  • Какие существуют типы верхних и нижних ограничителей для застежек-молний
  • Как предотвратить неправильное зацепление зубцов молнии Уголок палатки
  • Металлическая молния против. Спиральная молния: какая лучше для обуви

2 метода удержания прицепа (замки в доке) на погрузочной платформе

Ограничитель грузовика (или фиксатор дока) не позволяет грузовику двигаться во время погрузки и разгрузки.Если грузовик покидает погрузочную площадку до завершения погрузки и разгрузки, рабочие могут упасть в зазор между грузовиком и доком, что приведет к серьезным травмам или смерти, а груз и оборудование могут быть повреждены. Узнайте о 2 наиболее распространенных методах удержания прицепа.

Удерживающее устройство прицепа должно иметь возможность блокировки с приводным перегрузочным мостом, чтобы перегрузочный мост не мог работать, когда транспортное средство не удерживается.

Если на автомобиле нет буровой балки или удерживающее устройство прицепа не может сцепиться с буровой балкой, необходимо использовать альтернативный метод, например, использование противооткатных упоров.Оператор должен использовать функцию переопределения, чтобы перегрузочный мост мог работать. В таких случаях следует заблокировать колеса транспортного средства и принять меры предосторожности. Ограничители для прицепа бывают двух исполнений:

.

1. НЕЗАВИСИМЫЕ ОГРАНИЧИТЕЛИ ДЛЯ АВТОМОБИЛЯ

Самым распространенным типом удерживающих устройств для прицепов является система RIG-зависимая. Большинство внедорожных прицепов имеют защиту от удара сзади или RIG-дугу. Удерживающие системы, зависящие от RIG, используют удерживающий барьер, который поднимается вверх, захватывает штангу RIG прицепа и использует ее для фиксации прицепа на месте (Изображение 3 и Изображение 4).

Удерживающее устройство с электроприводом может использовать программируемые элементы управления, которые обеспечивают гибкость между удерживающим устройством и другим оборудованием погрузочной платформы. Датчик включения удерживающей системы RIG входит в стандартную комплектацию удерживающей системы с механическим приводом и является дополнительной функцией для удерживающей системы с ручным управлением. Противооткатный упор с ручным управлением представляет собой конический блок, который заклинивает перед колесами для предотвращения случайного движения.

Ограничители

RIG-зависимые доступны с ручным и механическим управлением. Эти ограничители могут задействовать противоподкатные защитные ограждения при отклонении от уклона от 7-1 / 2 до 30 дюймов. Ручное удерживающее устройство использует штангу для подъема и опускания защелки на удерживающем устройстве.

RIG Bar - автомобильное удерживающее устройство

Удерживающее устройство с механическим приводом использует кнопки для управления электродвигателем, пневматическим цилиндром или гидравлическим насосом и цилиндр для подъема и опускания удерживающего устройства (Изображение 5). Удерживающее устройство с электроприводом может использовать систему управления, которая обеспечивает гибкость между удерживающим устройством и другим оборудованием погрузочной платформы.


2. РУЧНЫЕ УПОРЫ КОЛЕСА

Противооткатный упор с ручным управлением - это конический блок, который заклинивает перед колесами для предотвращения случайного движения. Поскольку противооткатные упоры для колес не опираются на противооткатную балку в задней части прицепа, они более универсальны. Противооткатные упоры для колес могут удерживать прицепы с системами защиты днища, а также с гидравлическими подъемными воротами, сдвоенными сцепными устройствами и поврежденными ограждениями. На всех погрузочных площадках должны быть установлены противооткатные упоры.

НЕДОСТАТКИ РУЧНЫХ КОЛЕСА:

- Докеры могут посчитать противооткатные упоры неудобными и не использовать их.
- Прицеп не может быть закреплен, если противооткатные упоры под колеса потеряны или украдены.
- Установка противооткатных упоров вручную может занять много времени.
- Грузовик может тянуть прицеп через башмаки для колес, в то время как обычное устройство фиксации RIG выдерживает силу более 30 000 фунтов и более эффективно предотвращает непреднамеренный выезд прицепа.

Противооткатные упоры

Помимо использования транспортных средств удерживания, таких как противооткатные упоры и зависимые от буровой установки ограничители для защиты ваших рабочих от несчастных случаев, вы можете рассчитывать на наших надежных сервисных специалистов в Loading Dock, Inc., которые предложат быстрые и надежные решения для вашего оборудования погрузочной док-станции, такого как выравниватели док-станций, док-станции ножничные подъемники, док-бамперы и докшелтеры.

Нужно запланировать смету?

Для получения дополнительной информации позвоните нам по телефону 973-471-4060 или напишите нам по адресу info @ dockndoor.com

Мы обслуживаем Северный Нью-Джерси (Берген, Пассаик, Юнион, Эссекс, Моррис, Гудзон, Хантердон, графство / округа Сомерсет), Манхэттен, Нью-Йорк, Бруклин, Квинс, Статен-Айленд, Бронкс, Вестчестер и Рокленд.

Установить дату начала или окончания задачи (ограничение) для задачи

Что ты хочешь сделать?

Добавить ограничение для задачи

Если у вас есть неизбежное ограничение, такое как дата события, выберите тип ограничения, а также дату:

  1. В списке задач диаграммы Ганта дважды щелкните задачу.

  2. Щелкните вкладку Advanced .

  3. Выберите вариант из списка Тип ограничения .

  4. Если вы выбираете ограничение, отличное от «Как можно позже» или «Как можно скорее», добавьте дату в поле Дата ограничения .

Совет по управлению проектом Позвольте Project делать то, что он умеет лучше всего, - составлять график проекта. Задайте длительность задач самостоятельно и создайте связи между задачами, а затем Project рассчитает даты начала и окончания задачи.

Удалить ограничение

Технически удалить ограничение невозможно, но можно сбросить его до значения по умолчанию, привязав его к другим задачам, а не к определенной дате.

  1. В списке задач диаграммы Ганта дважды щелкните задачу.

  2. Щелкните вкладку Advanced .

  3. В списке Тип ограничения выберите один из следующих вариантов:

Доступные ограничения

С помощью Project вы можете добавить к задачам восемь различных ограничений.Эти ограничения бывают трех видов:

  • Гибкие ограничения , которые не привязывают задачу к определенной дате.

  • Полугибкие ограничения , которые включают самые ранние даты начала или самые поздние даты окончания.

  • Негибкие ограничения , у которых есть определенные даты начала или окончания.

Ограничение

Тип

Описание

Как можно позже (ALAP)

Гибкий

Задача запускается настолько поздно, насколько это возможно, не задерживая выполнение других задач.Это ограничение по умолчанию при планировании с даты окончания проекта.

Как можно скорее (как можно скорее)

Гибкий

Задача запускается как можно скорее. Это ограничение по умолчанию при планировании с даты начала проекта.

Запуск не ранее (SNET)

Полугибкий

Задача начинается не ранее определенной даты.

Финиш не раньше (FNET)

Полугибкий

Задача завершается в определенный день или позже.

Старт не позднее (SNLT)

Полугибкий

Задача начинается не ранее определенной даты.

Закончить не позднее (FNLT)

Полугибкий

Задача завершается не ранее определенной даты.

Должен закончиться (MFO)

негибкий

Задача завершается в определенный день.

Должен начаться (MSO)

негибкий

Задача начинается в определенный день.

Ограничения задач и зависимости задач

Легко спутать ограничения задачи (ограничения на то, когда задача может начаться или закончиться) с зависимостями задачи (ссылки, показывающие взаимосвязь между задачами).

Если вам нужна подробная информация о зависимостях, см. Связывание задач в проекте.

Эти инструкции относятся к Microsoft Project 2007.

Что ты хочешь сделать?

Об ограничениях

Есть три типа ограничений:

  • Гибкие ограничения не имеют конкретных дат, связанных с ними. Установка этих ограничений позволяет вам начинать задачи как можно раньше или как можно позже, при этом задача завершается до завершения проекта, учитывая другие ограничения и зависимости задач в расписании.

  • Для полугибких ограничений требуется связанная дата, которая управляет самой ранней или самой поздней датой начала или окончания задачи. Эти ограничения позволяют завершить задачу в любое время, если она соответствует крайнему сроку начала или окончания.

  • Для негибких ограничений требуется связанная дата, которая определяет дату начала или окончания задачи.Эти ограничения полезны, когда вам нужно, чтобы ваше расписание учитывало внешние факторы, такие как доступность оборудования или ресурсов, крайние сроки, контрольные точки контракта, а также даты начала и окончания.

В следующей таблице перечислены ограничения, предусмотренные в Project.

Тип ограничения

Имя ограничения

Описание

Гибкий

Как можно позже (ALAP)

Планирует задачу как можно позже с завершением задачи до завершения проекта и без задержки последующих задач.Это ограничение по умолчанию для задач при планировании с даты окончания проекта. Не вводите дату начала или окончания задачи с этим ограничением.

Гибкий

Как можно скорее (как можно скорее)

Планирует выполнение задачи как можно раньше.Это ограничение по умолчанию для задач при планировании с даты начала проекта. Не вводите дату начала или окончания с этим ограничением.

Полугибкий

Запуск не ранее (SNET)

Планирует запуск задачи на указанную дату или позже.Используйте это ограничение, чтобы гарантировать, что задача не начнется раньше указанной даты.

Полугибкий

Финиш не раньше (FNET)

Планирует выполнение задачи на указанную дату или позже. Используйте это ограничение, чтобы гарантировать, что задача не будет завершена до определенной даты.

Полугибкий

Старт не позднее (SNLT)

Планирует запуск задачи на указанную дату или раньше. Используйте это ограничение, чтобы задача не запускалась после указанной даты.

Полугибкий

Закончить не позднее (FNLT)

Планирует завершение задачи на указанную дату или раньше.Используйте это ограничение, чтобы гарантировать, что задача не будет завершена после определенной даты.

негибкий

Должен закончиться (MFO)

Планирует завершение задачи в указанную дату. Устанавливает даты раннего, запланированного и позднего завершения на дату, которую вы вводите, и привязывает задачу к расписанию.

негибкий

Должен начаться (MSO)

Планирует запуск задачи в указанную дату. Устанавливает даты раннего, запланированного и позднего начала на дату, которую вы вводите, и привязывает задачу к расписанию.

Если вы вручную вводите дату начала или дату окончания для задачи, Project изменяет тип ограничения для этой задачи на «Начать не раньше, чем» (SNET) или «Завершить не раньше, чем» (FNET). Эти полугибкие типы ограничений заставляют задачу начинаться или заканчиваться в указанную дату независимо от последующих изменений, которые в противном случае повлияли бы на место задачи в общем плане проекта.

Для оптимальной гибкости планирования мы рекомендуем разрешить Project использовать гибкие ограничения для расчета дат начала и окончания для задач на основе введенных вами длительностей и зависимостей задач.Только если у вас есть неизбежные ограничения, такие как дата события, которую нельзя переместить, вам следует рассмотреть возможность установки ограничения для задачи вручную.

Почему?

Ограничение задачи, которая зависит от другой задачи, может привести к нежелательным результатам, как показано в следующем примере:

Задача «Залить фундамент» связана так, что она запускается сразу после завершения «Выкопать яму».«Выкопать яму» предполагается 10-го числа. Если вы введете жесткое ограничение, которое заставляет «Залить фундамент» 10-го числа, а затем «Выкопать яму» заканчивается раньше, Project не сможет воспользоваться преимуществом раннего завершения и переместить «Заливку фундамента» на более раннее начало.

Вместо того, чтобы устанавливать конкретные даты для задачи, рассмотрите возможность назначения ограничения как можно скорее (ASAP) и введите крайний срок для задачи. Ввод крайнего срока приводит к тому, что Project отображает маркер крайнего срока в представлении диаграммы Ганта, а индикатор предупреждает вас, когда дата завершения задачи переходит за крайний срок.

Установить даты начала и окончания для задачи

Для оптимальной гибкости планирования мы рекомендуем разрешить Project вычислять даты начала и окончания для задач на основе введенных вами длительностей и зависимостей задач. Однако, если у вас есть неизбежные ограничения, такие как дата события, вы можете установить конкретную дату начала или окончания для задачи.

  1. В меню Просмотр щелкните Диаграмма Ганта .

  2. Щелкните задачу, которую вы планируете, а затем щелкните Информация о задаче .

  3. Щелкните вкладку Advanced .

  4. Выберите тип ограничения из списка Тип ограничения .

  5. Если вы выбираете ограничение, отличное от Как можно позже или Как можно скорее , введите дату ограничения в поле Дата ограничения или выберите дату в календаре.

Примечания:

  • Когда вы планируете свой проект с даты начала и вводите дату в поле Начало задачи (или перетаскиваете полосу диаграммы Ганта, чтобы изменить дату начала), Project устанавливает ограничение «Начать не раньше, чем» (SNET) для этой задачи. . Если вы введете дату в поле Завершить задачи, Project автоматически установит ограничение «Завершить не раньше, чем» (FNET).

  • Project 2007 по умолчанию запускает новые задачи в дату начала проекта, но вы можете указать, что новые задачи начинаются в текущую дату, а не в дату начала проекта. Выберите Инструменты > Параметры > Расписание , а затем в разделе Параметры планирования выберите Начать с текущей даты в списке Новые задачи .

Если у вас возникли проблемы с ограничениями вашей задачи, вы можете найти информацию в следующих разделах полезной.

Установить крайний срок для задачи

Вы можете установить крайний срок для задачи, чтобы отслеживать дату ее завершения, не блокируя расписание жестким ограничением. Project обновляет расписание по мере необходимости, отслеживает даты крайних сроков и показывает символ в столбце индикатора, если задача завершается по истечении крайнего срока.

Чтобы установить крайний срок для задачи:

  1. В меню Просмотр щелкните Диаграмма Ганта .

  2. Щелкните задачу, для которой вы назначаете крайний срок.

  3. Нажмите Информация о задаче , а затем щелкните вкладку Advanced .

  4. Введите дату крайнего срока в поле Крайний срок .

    Совет: Если позже вы решите, что вам больше не нужно устанавливать крайний срок для этой задачи, вы можете удалить крайний срок, сняв флажок Крайний срок .

  5. Нажмите ОК , чтобы сохранить крайний срок. Зеленая стрелка отображается рядом с полосой для задачи в представлении диаграммы Ганта. Project не уведомит вас, если крайний срок истечет.

Примечание. Когда задача выходит за пределы крайнего срока, Project вычисляет отрицательный резерв для этой задачи.Например, если задача завершается на день позже запланированного, отображается общий резерв -1d.

Изменить тип ограничения для задачи

Вы можете изменить тип ограничения для задачи в Project Guide , в диалоговом окне Task Information или в таблице Constraint Dates .

Внесите изменения в ограничения с помощью Руководства по проекту

  1. На панели инструментов Project Guide щелкните Tasks .

  2. На панели Задачи щелкните Установить крайние сроки и ограничить задачи .

  3. Выполните одно из следующих действий:

    • Чтобы выбрать отдельную задачу, щелкните имя задачи.

    • Чтобы выбрать более одной задачи, удерживайте нажатой клавишу CTRL и щелкните имя каждой задачи.

    • Чтобы выбрать все задачи в вашем проекте, нажмите Выбрать все .

  4. В разделе Ограничить задачу выберите тип ограничения, который вы хотите использовать для выбранной задачи или задач.

  5. Нажмите Готово .

Внесите изменения в ограничения в диалоговом окне «Информация о задаче»

  1. Щелкните задачу с ограничением, а затем щелкните Информация о задаче .

  2. На вкладке Advanced просмотрите или измените тип ограничения.

Примечание: Ограничения задачи также четко обозначены в столбце индикатора символом ограничения (либо или ).Наведите указатель на индикатор ограничения, чтобы увидеть тип и дату ограничения.

Внести изменения ограничений в таблицу дат ограничений

  1. В меню View щелкните More Views .

  2. В списке Views щелкните Task Sheet , а затем щелкните Apply .

  3. В меню Просмотр наведите указатель на Таблица , а затем щелкните Другие таблицы .

  4. Щелкните Task .

  5. В списке Таблицы щелкните Даты ограничений , а затем щелкните Применить .

    На листе задачи появится таблица Даты ограничений , в которой показаны имя задачи, продолжительность и тип ограничения для всех ограничений (включая Как можно скорее ), а также дату ограничения, если применимо.

  6. Выполните одно или оба из следующих действий:

    • Чтобы изменить тип ограничения, щелкните стрелку в поле Тип ограничения , а затем щелкните нужный тип ограничения.

    • Чтобы изменить дату ограничения, в поле Дата ограничения введите или выберите нужную дату.

      Если вы измените ограничение на как можно скорее (как можно скорее) или как можно позже (ALAP) , в поле Дата ограничения отобразится NA .

Не запирайтесь, избегая запирания

Одна из основных задач архитектора - создавать варианты.Эти варианты делают системы терпимыми к изменениям, поэтому мы можем отложить принятие решений до тех пор, пока не станет доступна дополнительная информация или реагировать на непредвиденные события. Блокировка делает обратное: затрудняет переключение с одного решения на другое. Поэтому многие архитекторы могут считать его своим заклятым врагом, в то время как они считают себя хранителями свободного мира. ИТ-системы, в которых компоненты заменяются и соединяются между собой по желанию.

Lock-in - заклятый враг архитектора?

Но архитектура редко бывает настолько простой - это дело компромиссов.Опытные архитекторы знают, что за блокировкой скрывается нечто большее, чем заявление о том, что ее следует избегать. У блокировки много граней, и она даже может быть предпочтительным решением. Итак, давайте войдем в лифт архитектора, чтобы поближе познакомиться с блокировкой.

Open-source-hybrid-multi-cloud == без блокировки?

Платформы, на которых мы развертываем программное обеспечение в наши дни, становятся все более популярными. более мощный - современные облачные платформы не только говорят нам, на нашем фото щенок или булочка, они также компилируют наш код, развертывают его, настраивают необходимую инфраструктуру и хранят наши данные.

Этот большой усилитель удобства и производительности также приносит новая форма блокировки. Гибридные / мультиоблачные системы, которые в наши дни, кажется, привлекают внимание многих архитекторов, являются хорошим примером того, о чем вам придется подумать, имея дело с блокировкой. Допустим, у вас есть приложение, которое вы хотите развернуть в облаке. Достаточно легко сделать, но от с точки зрения архитектора, есть много вариантов и даже больше компромиссов, особенно связанных с блокировкой.

Возможно, вы захотите развернуть свое приложение в контейнерах. Звучит неплохо, но стоит ли использовать AWS Elastic Container Service (ECS) для их запуска? В конце концов, это собственность облака Amazon. Предпочитаете Kubernetes? Он с открытым исходным кодом и работает в большинстве сред, в том числе локально. Задача решена? Не совсем так - теперь вы привязаны к Kubernetes - подумайте обо всех этих драгоценных файлах YAML! Значит, вы обменяли один замок на другой, не так ли? А если вы используете управляемые сервисы Kubernetes, такие как Google GKE или Amazon EKS, вы также можете быть привязаны к определенной версии Kubernetes и проприетарных расширений.

Если вам нужно, чтобы ваше программное обеспечение работало локально, вы также можете выбрать AWS. Аванпосты, так что у вас есть несколько вариантов. Но это опять-таки проприетарно. Он интегрируется с VMWare, к которому вы, вероятно, уже привязаны, так действительно ли это имеет значение? Эквивалент Google, недавно созданный Anthos, построен из компонентов с открытым исходным кодом, но, тем не менее, является проприетарным предложением: вы можете перемещать приложения в разные облака - пока вы продолжаете использовать Anthos. Это само определение блокировки, не так ли?

В качестве альтернативы, если вы аккуратно отделите автоматизацию развертывания от времени выполнения приложения, Разве это не упрощает переключение инфраструктуры, уменьшая эффект всей этой блокировки? Эй, есть даже кроссплатформенные инструменты инфраструктуры как кода.Разве это не должно полностью избавить от беспокойства?

Как насчет AWS S3 для ваших потребностей в хранилище? Другие облачные провайдеры предлагают S3-совместимые API, Итак, можно ли считать S3 совместимым с несколькими облаками и свободным от блокировки, даже несмотря на то, что он проприетарный? Вы также можете обернуть весь доступ к данным за слоем абстракции и таким образом локализовать любую зависимость. Это хорошая идея?

Похоже, избежать блокировки не так-то просто и может даже заставить вас попытаться сбежать из нее.Чтобы подчеркнуть, что облачная архитектура, тем не менее, забавна, я полагаюсь на взгляд Саймона Уордли на гибридное облако.

Шторы с замком

Запирание - это не дело «все или ничего».

Elevator Architects (те, кто ездит на лифте Architect вверх и вниз) видеть оттенки серого там, где многие видят только черный и белый. Когда думаешь Что касается системного дизайна, они понимают, что общие атрибуты, такие как блокировка или связь не является бинарной. Две системы не просто соединены или разъединены. как будто вы не просто привязаны к продукту или нет.Оба свойства имеют много нюансов. Например, блокировка распадается на множество размеры:

  • Привязка к поставщику : это тот вид, который обычно имеют в виду ИТ-специалисты когда они упоминают «блокировку». Он описывает сложность перехода с один поставщик к конкуренту. Например, при переходе с Siebel CRM на SalesForce CRM или из базы данных IBM DB2 в Oracle будет стоить вам рука и нога, вы "заперты". Этот тип блокировки распространен как поставщики в целом (более или менее явно) извлекают из этого выгоду.Эта блокировка включает коммерческие договоренности, такие как долгосрочное лицензирование и соглашения о поддержке, которые принесли вам скидку на возврат лицензионных сборов потом.
  • Блокировка продукта : Связанный, но другой блокируется в товар. При переходе с продукта одного поставщика на продукт другого поставщика вы обычно меняют и поставщика, и продукт, поэтому их легко объединены. Продукты с открытым исходным кодом могут избежать привязки к поставщику, но они не снимайте блокировку продукта: если вы используете Kubernetes или Кассандра, вы наверняка привязаны к API, конфигурациям и функциям конкретного продукта.Если ты работаешь в профессиональной (и особенно корпоративной) среде вам также понадобится коммерческая поддержка, которая снова привяжет вас к контракту с поставщиком - см. выше. Тяжелая настройка, точки интеграции и проприетарный расширения - это формы фиксации продукта: они затрудняют переключение на другой продукт, даже если это открытый исходный код.
  • Блокировка версии : помимо блокировки в продукте, вы можете даже быть привязанным к определенной версии.Обновление версии может быть дорогостоящим, если они нарушают существующие настройки и расширения, которые вы создали (SAP, любой?). Другие обновления версии по существу требуют, чтобы вы переписали свое приложение - AngularJS vs. Angular 2 приходит на ум. Что еще хуже, распространяется блокировка версий: определенный для версии продукта может потребоваться определенная (часто устаревшая) операционная система версия и так далее, что превращает любую попытку миграции в упражнение по бритью яка. Вы особенно плохо чувствуете эту привязку, когда продавец решает отказаться от вашей версии или прекратить поддержку всего продукта линия: вам нужно выбирать между отсутствием поддержки или серьезным капитальный ремонт.И все может стать еще хуже, например, если серьезная уязвимость системы безопасности найден в вашей старой версии и исправлений не предусмотрено.
  • Блокировка архитектуры : Вы также можете быть привязаны к определенному типу архитектуры. Например. когда вы активно используете Kubernetes, вы, вероятно, создание небольших сервисов, которые предоставляют API и могут быть развернуты как контейнеры. Если вы хотите перейти на бессерверную архитектуру, вам понадобится чтобы приблизить уровень детализации ваших услуг к отдельным функциям, внешнее управление состоянием, использование событийной архитектуры и, возможно, еще несколько вещей.Такие изменения не являются незначительными, но подразумевают серьезный пересмотр архитектуры вашего приложения.
  • Блокировка платформы : особый вид фиксации продукта заблокированы на платформе, особенно на облачных платформах. Таких платформ нет запускать только ваши приложения, но они также могут содержать ваши учетные записи пользователей и связанные права доступа, политики безопасности, сегментирование инфраструктуры и многие другие аспекты. Они также предоставляют услуги на уровне приложений, такие как как службы хранения или машинного обучения, которые обычно проприетарный.Отказ от этих сервисов может показаться способом уменьшить привязку к платформе. но это, в первую очередь, свело бы на нет одну из основных причин перехода к облаку. Люди, не занимающиеся программным обеспечением, называют это нахождение между камнем и наковальней.
  • Ограничение навыков : По мере того, как ваши разработчики знакомятся с определенного типа продукта или архитектуры, у вас будет блокировка навыков: это будет вам нужно время, чтобы переобучить (или нанять) разработчиков для другого продукта или технология.Поскольку наличие навыков является одним из основных ограничений в Сегодняшние ИТ-магазины такой тип запирания вполне реальны. Некоторое нишевое предприятие у продуктов есть особенно ограниченное количество разработчиков, из-за чего вы стоимость для разработчиков вырастет. Этот эффект особенно заметен для продукты, использующие специальные языки или, как ни странно, для "только конфигурация" / фреймворки без кода.
  • Юридическая блокировка : Вы можете быть заблокированы в конкретном решении для юридические причины, такие как соответствие.Например, вы не сможете перенести свои данные в центр обработки данных другого облачного провайдера, если он расположен за пределами твоя страна. Лицензия вашего поставщика программного обеспечения также может не позволять вам перемещать системы в облако, даже если они работали отлично. Если вы решите сделать в любом случае, вы нарушите условия лицензирования. Юридические аспекты проникают больше инженерные аспекты, чем мы обычно предполагаем: ваш маломоторный самолет вероятно, будет оснащен двигателем, который был разработан еще в 1970-х годах и горит сильно этилированное топливо: новые конструкции двигателей влекут за собой высокую юридическую ответственность.
  • Ментальная блокировка : Самый тонкий, но и самый опасный тип блокировки - это то, что влияет на ваше мышление. После работы с определенный набор поставщиков и архитектур, вы, вероятно, впитаете предположения в свою принятие решений, которые могут привести к отказу от альтернативных вариантов. Для Например, вы можете отклонить горизонтально масштабируемые архитектуры как неэффективные, потому что они не масштабируются линейно (вы не получите удвоения производительности при удвоении оборудования).Хотя этот способ мышления технически точен, он игнорирует тот факт, что масштабируемость, а не эффективность, является основным драйвером. Или вы можете возмущаться короткими циклами выпуска как вы заметили частые изменения, приводящие к большему количеству дефектов. И, конечно же, ты был сказал, что кодирование дорого, отнимает много времени и подвержено ошибкам, поэтому вам будет лучше все делаю через конфигурацию.

Программное обеспечение с открытым исходным кодом - не волшебное лекарство от блокировки.

Таким образом, запирание - это далеко не все, что нужно, поэтому понимание различные вкусы могут помочь вам принимать более осознанные архитектурные решения.Список также развенчивает распространенные мифы, такие как использование открытого исходного кода. программное обеспечение, волшебным образом устраняющее блокировку. Открытый исходный код может уменьшить поставщика блокировка, но большинство других типов блокировки остается. Это не значит открытый исходный код - это плохо, но это не волшебное лекарство от блокировки.

Принятие лучших решений с использованием моделей

Опытные архитекторы не только видят больше оттенков серого, но и хорошо практикуют дисциплина принятия решений. Это важно, потому что мы гораздо хуже принимаем решения чем мы обычно думаем - беглое прочтение книги Канемана «Размышления, пост и Если у вас есть какие-либо сомнения, то нужно медлить.

Один из самых эффективных способов улучшить процесс принятия решений - использовать модели. Даже или особенно простые модели удивительно эффективны при улучшение принятия решений:

Простые, но запоминающиеся модели - это подпись великого ученого, но чрезмерная проработка и чрезмерная параметризация часто является признаком посредственности.

- Джордж Бокс

Вот почему не стоит смеяться над знаменитой матрицей два на два, которую так любят консультанты по управлению.Это один из самых простых и поэтому наиболее эффективные модели, как мы скоро обнаружим.

Чем более неопределенна среда, тем более структурированные модели могут помочь вы принимаете лучшие решения.

Есть второй важный момент в моделях: распространенное мнение говорит нам, что перед лицом неопределенности вам в значительной степени придется «стрелять от бедра» - в конце концов, все равно все в движении. Противоположный на самом деле верно: наше в целом плохое принятие решений только ухудшается, когда мы иметь дело со многими взаимозависимостями, высокой степенью неопределенности и малой вероятностью.Следовательно, именно здесь модели больше всего помогают привнести столь необходимую структуру и дисциплину в процесс принятия решений. Решение о том, принимать ли блокировку и в какой степени, хорошо относится к этой категории, поэтому давайте воспользуемся некоторыми моделями.

Блокировка в виде матрицы два на два

Простая модель может помочь нам избавиться от клейма «запереть = плохо». Во-первых, мы должны понять, что трудно не быть запертыми в что угодно, поэтому некоторая блокировка неизбежна. Во-вторых, мы можем с радостью приму некоторую блокировку, если мы получим соизмеримую отдачу за пример в виде уникальной функции или утилиты, не предлагаемой конкурентоспособная продукция.

Выразим эти факторы в очень простой модели - матрице два на два:

В матрице наш выбор представлен по следующим осям:

  • стоимость переключения (также известная как «привязка»): насколько сложно нам будет перейти на другое решение?
  • уникальная утилита: сколько мы получаем от решения по сравнению с альтернативы?

Теперь мы можем рассмотреть каждый из четырех квадрантов:

  • Одноразовые : Компоненты, которые не имеют легко заменить - это те, о которых нам, возможно, придется меньше всего беспокоиться.Мы можем оставьте их как есть или, если возникнут какие-либо проблемы, мы легко их заменим. Не плохое место для обычных вещей. Например, большинство IDE для разработчиков (EMACS, вероятно, является заметным исключением!) Попадают в эту категорию: сочетание и подбирайте как хотите и не привязывайтесь к ним слишком сильно. Облачное хранилище для все ваши фотографии и другие личные данные также в значительной степени переместили ваш смартфон устройство в эту коробку, но об этом позже.
  • Accepted Lock-in : по диагонали компоненты, которые фиксируют вы выбираете конкретный продукт или поставщика, но взамен предоставляете вам уникальную функцию или полезность.Хотя мы обычно предпочитаем меньшую привязку, этот компромисс вполне может быть приемлемым. Вы можете использовать такие продукты, как Google Cloud BigQuery или AWS Bare. Металлические экземпляры, хорошо зная, что вы заперты, сделали осознанное решение, основанное на получаемой вами отдаче. Для небольшого приложения вы можете также с радостью используйте собственные сервисы AWS, потому что миграция маловероятна и сокращение затрат на разработку и эксплуатацию очень приветствуется.
  • Осторожно : наименее благоприятный ящик - это тот, который запирает вас, но не дает вам много уникальной полезности.Ваш традиционный реляционная база данных может попасть в это поле - использует ли какая-либо проприетарная база данных действительно увеличить свой доход? Не совсем. Однако миграция может потребовать много усилий, поэтому вам лучше убедиться, что вероятность того, что вы нужно сделать это. Если вы выбрали конкретное оборудование для своего встроенная система, которую вы запустили в космос, это, скорее всего, нормально - шансы на миграцию довольно низкие.
  • Ideal : лучшее - это то, что дает утилита, но в то же время от нее легко отказаться.Пока это звучит как идеал, к которому нужно стремиться, вы должны признать, что box - это своего рода оксюморон: если решение дает вам уникальную утилиту по определению у конкурентоспособных продуктов его не будет, что затруднит миграцию. S3 может быть подходящим примером для этого категория - несколько поставщиков облачных услуг приняли одни и те же API, относительно легко переключиться на, скажем, GCP. Тем не менее, в каждой реализации есть явные преимущества в отношении местоположения, производительности и т. д.Чтобы защитить такого рода переносимость между дифференцированными продуктами, важно, чтобы мы не разрешать защищать или патентовать API.

Хотя модель, по общему признанию, простая, размещение вашего программного обеспечения (и, возможно, оборудования) в эту матрицу. Это не только визуализирует ваше воздействие, но и хорошо сообщает о ваших решениях множеству заинтересованных сторон.

В качестве повседневного примера четырех квадрантов вы, возможно, решили использовать следующие элементы: которые дают вам различную степень блокировки и полезности (против часовой стрелки от верхнего правого угла):

  • Ваш любимый iPhone запирает вас в экосистему продавца, но он также дает уникальную утилиту, так что вы, скорее всего, получите этот Accepted Замок .
  • Ваш договор с оператором мобильной связи блокирует вас в единую сеть, но на самом деле не обеспечивает особой полезности по сравнению с другими сетями. Лучше выполнять Осторожно .
  • Зарядное устройство для телефона имеет стандартный разъем. К сожалению, многие айфоны нет, но, к счастью, адаптерный кабель по-прежнему делает этот гаджет одноразовым .
  • Многие из ваших приложений, таких как обмен сообщениями, предоставляют вам полезные функции, такие как друзей на нем, но они по-прежнему разработаны, чтобы упростить переключение, например, с помощью вашего список контактов телефона.Это Ideal .

Уникальная функция продукта не всегда превращается в уникальную полезность для вас.

Одно предупреждение по поводу уникальной утилиты : каждый поставщик собирается дать вам некую уникальную особенность - вот чем они отличаются. Однако здесь имеет значение, будет ли эта функция превращаться в конкретную и уникальное значение для вас и вашей организации. Например, некоторые облачные провайдеры запускают Сервисы с миллиардом пользователей в их удивительной глобальной сети.Это впечатляет и уникально, но вряд ли будет полезен для среднего предприятия, которое с радостью обслужит 1 миллионов клиентов и могут быть ограничены ведением бизнеса в одной стране. Некоторые люди до сих пор покупают Феррари в маленьких странах со строгими ограничениями скорости, так что видимо не все решение создание полностью рационально, но, возможно, Ferrari дает вам больше возможностей, чем облачная платформа.

Реальная стоимость блокировки

Поскольку эта простая матрица была очень полезной, давайте сделаем еще одну.В предыдущая матрица обрабатывает стоимость переключения как один элемент (или измерение). Хороший архитектор может видеть, что он разбивается на два измерения:

В матрице различаются затраты на переключение с вероятность того, что вы захотите (или захотите) переключиться. Вещи, у которых есть низкая вероятность и низкая стоимость не должны вас сильно беспокоить, а наоборот В конце концов, те, которые имеют высокую стоимость переключения и высокую вероятность переключения, не являются хорошо, и к нему следует обратиться.По другой диагонали вы берете свой шансы на те варианты, которые будут вам стоить, но маловероятны - здесь вы захотите купить страховку, например, ограничив объем изменений или увеличив свой бюджет на техническое обслуживание. Вы также можете принять риск - как часто вам действительно нужно было мигрировать с Oracle на DB2 или наоборот? Наконец, если переключатели, вероятно, будут дешевыми, вы добились гибкости - вы принимаете изменения и разрабатываете свой система за низкую стоимость ее выполнения. Как ни странно, этому квадранту часто уделяется меньше внимания, чем левому верхнему несмотря на то, что многие мелкие изменения складываются быстро.На работе мы принимаем неверные решения: маловероятный драма привлекает больше внимания, потому что а что, если !

Обсуждая вероятность блокировки, вы захотите рассмотреть различные варианты. сценариев, которые заставят вас переключиться: продавец может выйти из бизнеса, поднять цены или не может дольше иметь возможность поддерживать ваш масштаб или функциональные потребности. Интересно, что желание уменьшить блокировку иногда приходит в форме инструмента переговоров: когда обсуждая продление лицензии, вы можете намекнуть своему поставщику, архитектор которого вы создали ваша система так, чтобы отказ от их продукта был реалистичным и недорогим.Это может помочь вам договориться более низкая цена, потому что вы сообщили, что ваша BATNA - ваша Лучшей альтернативы согласованному соглашению мало. Это вариант архитектуры, который на самом деле не предназначен для использования - это сдерживающий фактор, вроде как склад оружия в холодной войне. Вы могли бы подделать это, а не на самом деле уменьшит блокировку, но вам лучше быть хорошим игроком в покер на случай, если продавец называет ваш блеф, например болтая со своими разработчиками у кулера для воды.

Снижение блокировки: цена исполнения

Еще раз проведя аналогию с опциями с самого начала, если избегание блокировки дает вам возможность выбора, то стоимость переключения - это цена исполнения опциона: это то, сколько вы платите за исполнение опциона.Чем ниже стоимость переключения, которую вы хотите достичь, тем выше стоимость опциона и, следовательно, цена. Пока мы мечтали о наличие всех систем в «зеленых ящиках» с минимальными затратами на переключение, необходимые инвестиции могут не окупиться.

Сведение к минимуму затрат на переключение может быть не самым экономичным выбором.

Например, многие архитекторы предпочитают не блокироваться в базе данных. поставщик или поставщик облачных услуг. Однако насколько вероятно переключение на самом деле? Может 5%, или даже ниже? Сколько вам будет стоить снижение стоимости переключения от, скажем, 50 000 долларов (для полуавтоматической миграции) до почти нуля? Вероятно намного больше, чем 2500 долларов (50 000 долларов x 5%), которые вы можете рассчитывать сэкономить.Следовательно, минимизация затрат на переключение - не единственная цель и легко может привести к чрезмерным инвестициям. Это эквивалент чрезмерной страховки: платить огромную премию, чтобы получить франшизу. снижение до нуля может дать вам душевное спокойствие, но зачастую это не самый экономичный и, следовательно, рациональный выбор.

Окончательная модель (на этот раз не матрица) может помочь вам решить, сколько вы должны инвестировать в сокращение стоимость переключения. На следующей диаграмме показана ваша ответственность, определяемая как произведение затрат на переключение, умноженное на вероятность того, что это произойдет по отношению к авансовые инвестиции, которые вам нужно сделать (синяя линия).

Инвестируя в опционы, вы, несомненно, можете снизить свои обязательства, либо за счет снижение вероятности переключения или снижение стоимости выполняя это. Например, с помощью объектно-реляционного сопоставления (ORM) фреймворк, такой как Hibernate, является небольшие вложения, которые могут уменьшить привязку к поставщику базы данных. Вы также могли создать метаязык, который будет переведен на родной язык каждого поставщика баз данных синтаксис хранимой процедуры. Это позволит вам полностью использовать производительность базы данных. не будучи зависимым, но это потребует много предварительных усилий для относительно маловероятный сценарий.

Таким образом, интересная функция - это красная линия, которая добавляет авансовые инвестиции в потенциальную ответственность. Это ваша общая стоимость и то, что вы должно быть минимальным. В большинстве случаев при увеличении авансовых инвестиций вы приблизитесь к оптимальному диапазону. Дополнительные инвестиции в снижение блокировки фактически приводят к более высокая общая стоимость. Причина проста: рентабельность инвестиций уменьшается, особенно для переключателей с малой вероятностью. Если мы сделаем наш архитектура очень гибкая, мы, вероятно, застряли в этой зоне чрезмерное инвестирование.Люди Ягни (они вам не понадобятся) могут стремиться к другой конец спектра - как это часто бывает, уловка состоит в том, чтобы найти счастливых средний.

Общая стоимость предотвращения блокировки

Теперь, когда мы довольно хорошо понимаем затраты и потенциальную отдачу быть запертым, нам нужно внимательнее взглянуть на общую стоимость избегает блокировки . В предыдущей модели мы предполагали, что избегание блокировки это простая стоимость. Однако на самом деле эту стоимость можно разбить на несколько составляющих:

Сложность может быть самой большой ценой, которую вы платите за сокращение блокировки.

  • Усилия : Это дополнительная работа, которая должна быть сделана в человеко-часах. Если мы выберем развертывание в контейнерах поверх Kubernetes, чтобы уменьшить привязку к облачному провайдеру, этот элемент будет включить усилия по изучению нового инструмента, написанию файлов Docker, настройке Kubernetes и др.
  • Расход : это дополнительные денежные расходы, например за товар лицензий, нанять внешних поставщиков или посетить KubeCon.
  • Недостаточное использование : Эти косвенные затраты возникают из-за того, что избежание блокировки часто не позволяет вам использовать зависящие от поставщика Особенности.В результате вы получаете меньше полезности от используемого программного обеспечения. Это, в свою очередь, может означать больше усилия по созданию недостающих функций, иначе это может вызвать слабость вашего продукта.
  • Сложность : Сложность - ключевой элемент уравнения, и слишком часто игнорируется. Многие усилия по уменьшению блокировки вводят дополнительный уровень абстракция: JDBC, контейнеры, общие API. Пока все полезные инструменты, такие как Слой добавляет еще одну движущуюся часть, увеличивая общую сложность системы.Это, в свою очередь, увеличивает усилия по обучению для новых членов команды и увеличивает вероятность системных ошибок.
  • Новые блокировки : предотвращение одной блокировки часто происходит за счет другой. Например, вы можете отказаться от использования AWS. CloudFormation и вместо этого используйте Hashicorp's Terraform или Pulumi, оба поддерживают несколько облачных провайдеров. Однако теперь вы заблокированы другим продуктом. от дополнительного поставщика, и вам нужно выяснить, подходит ли вам это.

При расчете стоимости избежания блокировки архитектор должен быстро просмотрите этот список, чтобы избежать слепых пятен.Также имейте в виду, что попытки избежать блокировки могут быть ненадежными, очень похоже на дырявые абстракции. Например, Terraform - прекрасный инструмент, но в его скриптах используется множество конструкций, зависящих от производителя. Таким образом, детали реализации "просачиваются", что делает стоимость переключения с одного облака на другое явно ненулевым.

Собираем все вместе

Имея столько теории, давайте рассмотрим несколько конкретных примеров.

Развертывание контейнеров

Я работал с компанией, которая упаковывает большую часть своего кода в Docker. контейнеры, которые они развертывают в AWS ECS.Таким образом, они заблокированы в AWS. Стоит ли им инвестировать в замену оркестровки контейнеров на Kubernetes, который является открытым исходным кодом? Учитывая, что скорость функции является их основным беспокойство, и текущее решение ECS работает для них, я не думаю, что миграция окупится. Вероятность перехода на другое облако поставщик низкий, и у них есть «рыба покрупнее, чтобы поджарить».

Рекомендация : принять блокировку.

Доступ к реляционной базе данных

Многие приложения используют реляционную базу данных, которая может быть предоставлена ​​множеством поставщики и альтернативы с открытым исходным кодом.Однако диалекты SQL, хранимые процедуры и все индивидуальные консоли управления способствуют блокировке базы данных. Сколько следует вы вкладываете деньги в то, чтобы избежать этой блокировки? Для большинства языков и сред выполнения общие каркасы, такие как Hibernate , обеспечивают некоторый уровень нейтральности базы данных при невысокой стоимости. Если вы хотите еще больше минимизировать свою страйк-цену, вам также следует избегать функций SQL и хранимых процедур, что может снизить производительность вашего продукта или потребовать дополнительных затрат на оборудование.

Рекомендация : используйте механизмы с низким усилием, чтобы уменьшить блокировку. Не целься для нулевой стоимости переключения.

Переход в облако

Вместо того, чтобы переключаться с одного поставщика базы данных на другого, вас может больше заинтересовать перенос вашего приложения, включая его базу данных, в облако. Помимо технических соображений, вам нужно быть осторожным с лицензионными соглашениями некоторых поставщиков, которые могут сделать такой шаг нерентабельным. В этих случаях разумно выбрать базу данных с открытым исходным кодом.

Рекомендация : выберите базу данных с открытым исходным кодом, если она может удовлетворить ваши операционные потребности и потребности в поддержке, но примите некоторую степень блокировки.

Мультиоблачность

Многие предприятия увлечены идеей переносимых мультиоблачных развертываний и придумывают более сложные и сложные (и дорогие) планы, которые якобы избавят их от привязки к облачным провайдерам. Однако большинство из этих подходов отрицает саму причину, по которой вы хотели бы перейти в облако: низкое трение и возможность использовать размещенные службы, такие как хранилище или базы данных.

Рекомендация : Соблюдайте осторожность. Прочтите мою статью о мультиоблаке.

Архитектура со скоростью мысли

Может показаться, что на созерцание можно потратить уйму времени. блокировка. Некоторые могут даже отвергнуть наш подход как "академический" - слово, которое я неоднократно ошибаюсь. видеть что-то плохое, потому что именно там большинство из нас получило образование. Тем не менее, разве старый метод построения архитектуры «черно-белый» не проще и, возможно, эффективнее?

Архитектурное мышление на самом деле удивительно быстро, если вы сосредотачиваетесь и придерживаетесь простых моделей.

На самом деле мышление происходит очень быстро. Пробежавшись по всем моделям показанное в этой статье может занять всего несколько минут и привести к хорошо задокументированным решениям. Никаких причудливых инструментов, кроме листа бумаги или доски, не требуется. Ключевым ингредиентом быстрого архитектурного мышления является просто способность сосредоточиться.

Сравните это с усилиями по подготовке сложных слайдов для длительного рулевого управления. заседания комитета, которые назначаются за много недель и обычно не проводятся любой присутствующий, у которого есть реальный опыт, чтобы принять обоснованное решение.

Архитекторы лифтов предпочитают тратить время на обдумывание ожиданий встречи.


Границы | Сверхэкспрессия dilp2 вызывает полулетальность, зависящую от питательных веществ, у Drosophila

.

Введение

У млекопитающих пептидный гормон инсулин способствует захвату глюкозы в мышцах и жировых тканях, индуцирует рост и пролиферацию клеток и стимулирует гликонеогенез, липогенез и синтез белка (Saltiel and Kahn, 2001). Сигнал инсулина / инсулиноподобного фактора роста (IGF) эволюционно сохраняется во всех многоклеточных организмах (Skorokhod et al., 1999). У насекомых Drosophila широко использовалась в качестве модельной системы для изучения передачи сигналов инсулина, которая играет важную роль в регуляции роста органов и окончательного размера организма.

Drosophila обладает восемью инсулиноподобными пептидами ( Dilps ), которые могут активировать рецептор инсулина Drosophila , InR (Brogiolo et al., 2001). Среди инсулиноподобных пептидов Drosophila ( Ilp s), dilp2 является наиболее экспрессируемым и имеет самый высокий потенциал для стимулирования роста тканей (Ikeya et al., 2002; Рулифсон и др., 2002; Broughton et al., 2005). Было продемонстрировано, что уменьшение dilp2 увеличивает содержание сахара в крови насекомых, трегалозы, у взрослых мух, что позволяет предположить, что dilp2 регулирует гомеостаз глюкозы у Drosophila , как и у млекопитающих (Broughton et al., 2008). ). Кроме того, было показано, что снижение экспрессии dilp2 увеличивает продолжительность жизни, что указывает на то, что dilp2 играет важную роль в определении продолжительности жизни (Broughton et al., 2008).

С другой стороны, избыточная активация передачи сигналов инсулина может нарушать физиологию организмов. Было высказано предположение, что у людей повышенный уровень инсулина в крови является основной причиной диабета 2 типа, связанного с гипертонией и раком (Новосядлый и Леройт, 2010). Фактически, гиперинсулинемия, то есть чрезмерный уровень инсулина в крови, часто наблюдается при нескольких метаболических заболеваниях, таких как сахарный диабет 2 типа (Samuel and Shulman, 2012). Однако сосуществование гипергликемии, инсулинорезистентности и других гормональных и метаболических изменений у пациентов с диабетом 2 типа затрудняет понимание причинной роли избыточной передачи сигналов инсулина в патофизиологии гиперинсулинемии (Corkey, 2012).Было разработано несколько моделей гиперинсулинемии на животных путем сверхэкспрессии InR или IGFR в некоторых тканях, путем кратковременного введения инсулина или путем кормления животных диетой с высоким содержанием сахара (Musselman et al., 2011). Хотя эти модели внесли свой вклад в выяснение молекулярных механизмов, которые регулируют передачу сигналов инсулина / IGF, остается неясным, как гиперинсулинемия влияет на физиологию животных.

Было продемонстрировано, что состав рациона также влияет на физиологию и продолжительность жизни людей.У Drosophila баланс потребления белков и углеводов является одним из критических факторов, определяющих продолжительность жизни и плодовитость (Lee et al., 2008; Skorupa et al., 2008; Lushchak et al., 2012). Например, мухи, которых выращивают на кормах, богатых глюкозой / бедных белками, обычно становятся тучными с возрастом и демонстрируют более короткую продолжительность жизни, и наоборот. Хотя передача сигналов инсулина / IGF играет решающую роль в регуляции поглощения глюкозы, неясно, как этот сигнал влияет на физиологические изменения, зависящие от состава рациона.

Чтобы исследовать, как избыток инсулина влияет на физиологию насекомых, мы создали трансгенных мух с высоким уровнем dilp2 и проанализировали их фенотипы. Сверхэкспрессия dilp2 увеличивала размер тела и вызывала полусмертность. Эти фенотипы частично подавлялись мутациями в компонентах пути передачи сигналов инсулин / IGF, что позволяет предположить, что гиперактивация передачи сигналов инсулин / IGF токсична для мух. Мы обнаружили, что мухи с повышенной экспрессией dilp2 проявляют интенсивную аутофагию в клетках жирового тела.Интересно, что увеличение содержания белка по сравнению с глюкозой в среде частично спасало индуцированную dilp2 полулетальность и аутофагию. Наши результаты показывают, что избыточная передача сигналов инсулина / IGF ухудшает физиологию животных, но ее можно улучшить, контролируя пищевой баланс между белками и углеводами, по крайней мере, у мух.

Материалы и методы

Fly Stocks and Media

UAS-dilp2 (Brogiolo et al., 2001), Akt1 1 (Stocker et al., 2002) и InR 304 (Brogiolo et al., 2001) были любезно предоставлены доктором Э. Хафеном. PTEN dj189 был подарком доктора Д. Пэна (Gao et al., 2000). Tor K17004 (Oldham et al., 2000), S6K 07064 (Montagne et al., 1999) и M {3xP3-RFP.attP} ZH-51D и M {3xP3-RFP.attP} ZH-68E (Bischof et al., 2007) были получены из Bloomington Stock Center.Мух выращивали при 25 ° C на стандартной среде из кукурузной муки [3,6% нейтрализованных дрожжей (Asahi Breweries, LTD. Y-4), 8,1% кукурузной муки, 10% глюкозы и 0,7% агара] с пропионовой кислотой и n -бутил. p -гидроксибензоат в качестве ингибиторов плесени, если не указано иное. Для удобства приготовления мы использовали другую среду. Drosophila Instant Medium (Formula 4-24, Carolina Biological. Supply, Burlington, NC) использовали в качестве основной среды для приготовления сред, содержащих различные концентрации дрожжевых экстрактов: 2 г Drosophila Instant Medium смешивали с 5 мл дрожжевого экстракта Bacto ™ (Difco Laboratories, Детройт, штат Мичиган, США), растворенного в воде в четырех различных концентрациях (0, 10, 20 и 40 г / л).Стандартная агаровая среда из кукурузной муки использовалась для приготовления сред, содержащих глюкозу в четырех различных концентрациях (0, 100, 200 и 300 г / л).

Эксперименты по генетическому взаимодействию

Чтобы облегчить эксперименты по генетическому взаимодействию, мы создали запас sd-Gal4 / sd-Gal4; UAS-dilp2 / TM6B, tub-Gal80 , в котором GAL4-зависимая экспрессия dilp2 репрессируется GAL80. Шток удобен для тестирования эффектов мутаций на фенотип, вызванных сверхэкспрессией dilp2 .Для внутреннего контроля мы сделали мух гетерозиготными по мутации с гомологичной хромосомой, помеченной RFP: мутации, сцепленные со второй хромосомой ( Tor K17004 и PTEN dj189 ) и сцепленные с третьей хромосомой. мутации ( Akt1 1 , InR 304 и S6K 07064 ) были скрещены с M {3xP3-RFP.attP} ZH- M и 3xP3-RFP.attP} ZH-68E соответственно. Потомства F1 (мутации / 3xP3-RFP ) были скрещены с sd-Gal4 / sd-Gal4; UAS-dilp2 / TM6B, tub-Gal80 летает. Количество полученных потомств ( sd-Gal4 / +; UAS-dilp2 / + с мутациями) и их контрольные братья-сестры ( sd-Gal4 / +; UAS-dilp2 / + с 3xP3-RFP ) были подсчитаны и рассчитаны относительные жизнеспособности.

Измерение массы тела и размера крыла

Взрослых мух взвешивали с использованием аналитических полумикровесов (A&D Company, Tokyo, Japan).Для измерения размера крыла правые крылья взрослых мух были оторваны с помощью щипцов и помещены на предметное стекло для микроскопа с использованием капли Fly Line Dressing (TIEMCO, Токио, Япония), силиконовой смазки с очень низким поверхностным натяжением (Tsuda et al. др., 2010). Крылья фотографировали с помощью стереомикроскопа MZ APO (Leica, Wetzlar, Германия), оснащенного цифровой камерой DP50 (Olympus, Токио, Япония), при постоянном увеличении. Площадь крыльев измеряли с помощью программного обеспечения ImageJ (NIH).

Количественная ПЦР в реальном времени

Суммарную РНК

из взрослых мух экстрагировали с использованием TRIzol ® (Qiagen, Валенсия, Калифорния, США), и она была подвергнута обратной транскрипции с использованием ReverTra Ace ® (Toyobo, Осака, Япония).Количественные реакции ПЦР проводили с использованием SYBR ® Premix Ex Taq ™ (Takara Bio, Otsu, Japan).

Вестерн-блоттинг

Взрослых мух гомогенизировали в буфере для образцов SDS (12,5 мМ Трис (pH 6,8), 20% глицерин, 4% SDS, 2% 2-меркаптоэтанол и 0,001% бромфенолового синего) и кипятили в течение 10 минут при 95 ° C. Образцы разделяли с помощью 10% SDS-PAGE и переносили на PVDF-мембраны (GE Healthcare, Бакингемшир, Великобритания). После блокирования 5% бычьим сывороточным альбумином (Sigma-Aldrich, St.Louis, MO, USA), мембраны инкубировали с первичным антителом в трис-буферном солевом растворе (TBS), содержащем твин-20 (TBST), в течение ночи при 4 ° C, а затем с вторичным антителом в TBST в течение 1 ч при 25 ° C. . Сигналы были обнаружены с помощью набора ECL-plus (GE Healthcare). В качестве первичных антител использовали кроличьи антитела против фосфо-Akt (Cell Signaling Technology, Данверс, Массачусетс, США), кроличьи антитела против фосфо-p70 S6-киназы (Cell Signaling Technology) и мышиные антитела против α-тубулина (Sigma-Aldrich). используется при разведении 1: 1000, 1: 1000 и 1: 5000 соответственно.HRP-конъюгированный анти-кроличий IgG (Cell Signaling Technology) и HRP-конъюгированный антимышиный IgG (GE Healthcare) использовали в качестве вторичных антител при разведениях 1: 2000 и 1: 1000 соответственно.

Жидкостная хроматография в сочетании с тандемной масс-спектрометрией (ЖХ-МС / МС)

LC-MS / MS использовали для определения концентраций глюкозы, трегалозы, метаболитов глюкозы и свободных аминокислот. Десять самок мух взвешивали и гомогенизировали с 75% ацетонитрилом на льду. Гомогенаты центрифугировали в течение 10 минут при 2400 × g, а супернатант повторно центрифугировали в течение 10 минут при 1200 × g.Супернатант выпаривали и растворяли до подвижной фазы (10 мМ DBAA, Tokyo Chemical Industry, Токио, Япония) в H 2 O (pH 4,75). После центрифугирования при 1200 × g для удаления остатка супернатанты собирали и использовали для анализа метаболома с помощью системы Waters LC-QTofMS, состоящей из LC (Acquity UPLC) и MS (Xevo ™ QTofMS) (Waters, Milford, MA, USA). Метаболиты разделяли на колонке Acquity ® UPLC HSS T3 (2,1 Å ~ 100 мм, 1,8 мкм; Waters). Для углеродных метаболитов колонки уравновешивали 10 мМ DBAA (Tokyo Chemical Industry) в H 2 O (pH 4.75), и соединения элюировали возрастающим градиентом ацетонитрила. Общее время работы 20 мин. Система МС была оборудована двойным ионизационным зондом с электрораспылением и работала в режиме отрицательных ионов с температурой источника 120 ° C. Что касается аминокислот, аналиты разделяли градиентом подвижной фазы от воды, содержащей 0,05% уксусной кислоты, до метанола в течение 15 минут. Капиллярное напряжение и конусное напряжение для ионизации электрораспылением поддерживали на уровне 0.7 кВ и 15 В для обнаружения отрицательного режима и при 0,7 кВ и 13 В для обнаружения положительного режима соответственно. Температура источника и температура десольватации были установлены на 120 и 350 ° C соответственно. Азот использовали как в качестве газа конуса (50 л / ч), так и в качестве газа для десольватации (600 л / ч), а в качестве газа столкновений использовали аргон. Для точного измерения массы масс-спектрометр был откалиброван с помощью раствора формиата натрия (диапазон m / z 50–1000) и контролировался с помощью периодической инъекции лейцин-энкефалина фиксированной массы ([M + H] + = 556.2771 m / z и [M - H] - = 554,2615 m / z) в реальном времени. Данные МС анализировали с использованием QuanLynx ™ (Waters). Соединения были идентифицированы на основании их времени удерживания, их отношения m / z и спектра МС / МС стандартных эталонных материалов.

Измерение содержания белка

Концентрацию растворимого белка измеряли с помощью реагента для анализа белка Bio-Rad. Для каждого генотипа было проведено не менее трех испытаний.

Измерение триглицеридов

Десять взрослых мух взвешивали и гомогенизировали в 1% Triton-X.Гомогенаты нагревали 10 мин при 70 ° C и хранили при -80 ° C. После оттаивания на льду образцы центрифугировали 10 мин при 14,700 × g при 25 ° C. Количество триглицеридов (ТАГ) определяли с использованием набора для определения триглицеридов в сыворотке (TR0100; Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США). Все данные были нормализованы по содержанию растворимого белка в гомогенатах. Для определения среднего количества триглицеридов использовали не менее трех образцов.

Окрашивание аутофагии

Жировые тельца отделяли от первых третьих личинок в PBS и инкубировали с LysoTracker ® Red DND-99 (Molecular Probes ® , Life Technologies, Grand Island, NY, USA) в разведении 1: 1000 в PBS для 1 мин при комнатной температуре.После непродолжительной промывки в PBS образец наблюдали под лазерным сканирующим конфокальным микроскопом Nikon C1.

Результаты и обсуждение

Сверхэкспрессия

dilp2 снижает жизнеспособность мух от яйца до взрослой особи

Для создания модели гиперинсулинемии у трансгенных мух мы сверхэкспрессировали dilp2 , который, как известно, способствует росту тканей у Drosophila . Мы обнаружили, что мухи показывают высокую летальность, когда повсеместно сверхэкспрессируется dilp2 с использованием actin5c-Gal4 , что позволяет предположить, что высокие уровни Dilp2 токсичны для мух.Однако причина этой летальности не была выяснена. Альтернативный драйвер, который дает более мягкий фенотип, был бы полезен для исследования токсичности для развития, связанной со сверхэкспрессией dilp2 . Мы протестировали несколько линий Gal4, и обнаружили, что sd-Gal4 , который преимущественно экспрессирует Gal4 при формировании имагинальных крыльевых дисков, был подходящим драйвером. Когда sd-Gal4 был скрещен с UAS-dilp2 , количество потомков от скрещивания было значительно меньше, чем количество потомков, полученных от родительских линий, тем самым предполагая, что сверхэкспрессия dilp2 была токсичной для мух.Для более количественного определения жизнеспособности сравнивали количество потомков мух с избыточной экспрессией dilp2 и их братьев и сестер, несущих хромосому M {3xP3-RFP.attP} ZH-68E , экспрессирующую белок красной флуоресценции (RFP) под контролем. искусственного промотора 3xP3 (Bischof et al., 2007). Самок, гомозиготных по sd-Gal4 , скрестили с гетерозиготными самцами UAS-dilp2M {{3xP3-RFP.attP} ZH-68E и подсчитали количество взрослых мух.Теоретически одна половина потомства наследует и экспрессирует UAS-dilp2 под контролем sd-Gal4 , а другая половина, служащая внутренним контролем, несет хромосому, несущую RFP. Число мух с повышенной экспрессией dilp2 было заметно снижено по сравнению с таковым из контрольных мух (фигура 1A). Оба пола полусмертельны, но последствия были более серьезными у мужчин, чем у женщин. Вероятно, это связано с механизмом компенсации доз, поскольку sd-Gal4 является X-связанным трансгеном, который стимулирует экспрессию dilp2 в два раза выше у мужчин (Рисунок 1B).

Рис. 1. Избыточная экспрессия dilp2 увеличивает размер тела и вызывает полусмертность. Относительная жизнеспособность мух с повышенной экспрессией dilp2 (A) . Мух, гомозиготных по sd-Gal4 , скрещивали с самцами UAS-dilp2 / 3xP3-RFP , и количество мух, экспрессирующих RFP, служило внутренним контролем; те, кто не экспрессирует RFP, экспрессируют dilp2 . Уровень экспрессии Gal4 в sd-Gal4 мужской намного выше, чем у sd-Gal4 женский (B) .Сверхэкспрессия dilp2 вызвала полусмертность как для мужчин, так и для женщин. Относительный уровень экспрессии мРНК dilp2 у мух с избыточной экспрессией dilp2 ( sd > dilp2 ) и родительских линий ( sd-Gal4 и UAS-dilp2 ) служил в качестве контроля и был определен с помощью ОТ-ПЦР в реальном времени (C) . dilp2 -сверхэкспрессирующие мухи имеют увеличенный размер тела (D) , увеличенную площадь крыла на 17% (E) и увеличенный вес на 50% (F) .Стьюдент t -тест был проведен для анализа статистической значимости. * p <0,01.

Используя самок мух, доживших до взрослой стадии, мы определили уровень экспрессии dilp2 у самок. Количественная ПЦР в режиме реального времени показала, что уровни мРНК dilp2 у взрослой самки увеличились в 16 раз по сравнению с контролем, что свидетельствует о сверхэкспрессии dilp2 , которая токсична для развития мух (рисунок 1C).

Мы также заметили, что размер тела мух sd > dilp2 , доживших до взрослой стадии, был больше, чем у контрольной группы (рис. 1D). Для более точного сравнения размеров тела измеряли размер крыла, как описано в разделе «Материалы и методы». Размер крыла мух sd > dilp2 был увеличен на 17% по сравнению с размером крыла контрольных мух (рис. 1E). Кроме того, масса тела мух с повышенной экспрессией dilp2 увеличилась на 50% по сравнению с контрольными мухами (рис. 1F).Эти результаты показали, что сверхэкспрессия dilp2 вызывала полулетальность, но способствовала росту выживших.

Путь PI3K / AKt1 опосредует

dilp2 - индуцированная полусмертность

dilp2 стимулирует путь PI3K / Akt1 посредством активации рецептора инсулина (InR). Вестерн-блоттинг показал, что активная форма Akt1 была значительно увеличена у мух с избыточной экспрессией dilp2 по сравнению с контролем, что указывает на то, что сверхэкспрессия dilp2 действительно активирует передачу сигналов PI3K / Akt1 (рис. 2, верхняя панель).Чтобы еще раз подтвердить это, мы исследовали, влияют ли мутации в компонентах пути на индуцированную dilp2 полулетальность. Мы обнаружили, что как для самцов, так и для самок гетерозиготные мухи, несущие мутацию потери функции в InR или Akt1, показали более высокие уровни жизнеспособности по сравнению с контрольными мухами (рис. 3А). С другой стороны, мутация потери функции в Ptne, негативном регуляторе PI3K, дополнительно снижает жизнеспособность мух с повышенной экспрессией dilp2 (рис. 3А).Эти результаты предполагают, что индуцированная dilp2 полулетальность опосредуется передачей сигналов PI3K / Akt1. Сверхэкспрессия IlpP2 также активировала передачу сигналов Tor / S6K, нижележащий сигнальный компонент передачи сигналов PI3K / Akt1, поскольку уровень фосфорилированного S6K был повышен (рис. 2, средняя панель). Однако, что интересно, мутации с потерей функции в Tor или S6K не повлияли на снижение жизнеспособности мух с избыточной экспрессией dilp2 , что позволяет предположить, что передача сигналов Tor / S6K не имеет отношения к полулетальности или единичным копиям мутаций было недостаточно, чтобы подавить полувылетание, вызванное dilp2 (рис. 3В).

Рисунок 2. dilp2 -сверхэкспрессия активирует киназы Akt1 и S6 (S6K). Количество фосфорилированных Akt1 и S6K анализировали с помощью вестерн-блоттинга. α-тубулин использовали в качестве контроля нагрузки.

Рисунок 3. Генетические манипуляции с InR / Akt1 / PI3K изменяют летальность, вызванную dilp2 . Относительная жизнеспособность мух sd > dilp2 была определена в сочетании с мутациями потери функции в InR , Akt1 или PI3K , которые являются компонентами сигнального пути инсулина / IGF. dilp2 - индуцированная полусмертность была заметно улучшена за счет уменьшения InR или Akt1 , но увеличилась за счет уменьшения PTEN (A) . Относительная жизнеспособность мух sd > dilp2 в сочетании с мутациями потери функции в Tor и S6K (B) . Путь Tor / S6K может не вносить вклад в опосредование полулетальности мух с повышенной экспрессией dilp2 . Стьюдент t -тест был проведен для анализа статистической значимости.* p <0,05, ** p <0,01.

Глюкоза и метаболизм липидов у мух с избыточной экспрессией

dilp2

Затем мы исследовали, нарушает ли сверхэкспрессия dilp2 гомеостаз и метаболизм глюкозы. Сначала мы измерили концентрацию глюкозы и трегалозы, основных сахаров в крови у насекомых. Не было значительной разницы в концентрации этих сахаров между мухами с повышенной экспрессией dilp2 ( sd > dilp2 ) и родительскими линиями ( sd-Gal4 или UAS-dilp2 ) в качестве контрольных (рис. 4).Мы также измерили количество метаболитов гликолиза и цикла TCA, используя жидкостную хроматографию в сочетании с тандемной масс-спектрометрией (LC-MS / MS) с ионно-парными реагентами (рисунки 5A, B). Не было существенной разницы в количествах гликолитических метаболитов между мухами с повышенной экспрессией dilp2 ( sd > dilp2 ) и родительскими линиями ( sd-Gal4 или UAS-dilp2 ) в качестве контрольных. Эти результаты предполагают, что сам гомеостаз глюкозы не подвергался влиянию сверхэкспрессии dilp2 .Для метаболитов цикла TCA количество сукцината, фумарата и малата было немного увеличено у мух с повышенной экспрессией dilp2 . Поскольку было показано, что фумарат и малат увеличивают продолжительность жизни у Caenorhabditis elegans (Edwards et al., 2013), избыточная экспрессия dilp2 может влиять на энергетический метаболизм, связанный с определением продолжительности жизни.

Рис. 4. Содержание трегалозы и глюкозы у мух с повышенной экспрессией dilp2 . Относительное количество глюкозы и трегалозы у мух sd > dilp2 было рассчитано на основе значений родительской линии ( sd-Gal4 ) и указано как среднее ± стандартная ошибка по крайней мере трех образцов с минимумом пять мух на группу. Не было значительной разницы в количестве этих сахаров.

Рисунок 5. Метаболизм глюкозы у мух с повышенной экспрессией dilp2 . Гликолиз (A) и цикл TCA (B) метаболитов анализировали с помощью LC-MS / MS в отрицательном режиме.Относительные количества метаболитов у мух sd > dilp2 были рассчитаны на основе значений родительских линий ( sd-Gal4 ) и показаны как среднее значение ± стандартная ошибка не менее трех образцов с минимум пятью мухами на группа. G6P: глюкозо-6-фосфат; F6P: фруктозо-6-фосфат; F1,6BP: фруктозо-1,6-бисфосфат; 2/3-PG: 2/3-фосфоглицерат; PEP: фосфоенолпируват. Стьюдент t -тест был проведен для анализа статистической значимости. * р <0.05

Передача сигналов инсулина / IGF может подавлять катаболизм липидов посредством регуляции липаз (Xu et al., 2012). Таким образом, затем мы измерили содержание липидов у мух с повышенной экспрессией dilp2 и контрольных родительских линий. Не было значительной разницы в уровне триацилглицерина, самого распространенного из запасных липидов (рис. 6А). Кроме того, количественный анализ ПЦР в реальном времени показал, что уровни экспрессии четырех основных липаз Drosophila , doppelganger von brummer ( dob ), brummer ( bmm ), CG5966 и CG5966 и CG (Гронке и др., 2005) не были изменены у мух с избыточной экспрессией dilp2 (фиг. 6B). Уровень экспрессии bmm в родительской линии, UAS-dilp2 был значительно ниже, чем у другой родительской линии sd-Gal4 и их потомства sd > dilp2 . Могут существовать неизвестные механизмы, которые подавляют экспрессию bmm на фоне линии UAS-dilp2 . Мы также сравнили уровни экспрессии bmm между sd > dilp2 и sd-Gal4 , 3xP3-RFP мух и обнаружили, что не было значительных изменений в уровне экспрессии bmm , когда dilp2 был сверхэкспрессирован (данные не показаны).

Рис. 6. Липидный метаболизм у мух с повышенной экспрессией dilp2 . Сравнение уровней ТАГ у мух с повышенной экспрессией dilp2 и родительских линий в качестве контролей (A) . Относительные уровни мРНК четырех основных генов, участвующих в катаболизме липидов у Drosophila , doppelganger von brummer ( dob ), brummer ( bmm ), CG5966 и CG5966 и BG4 9106Результаты показаны как среднее значение ± стандартная ошибка по крайней мере трех экспериментов. ANOVA с Tukeys HSD был выполнен для анализа статистической значимости. * p <0,01.

Эти результаты предполагают, что сверхэкспрессия dilp2 не влияет на накопление липидов и катаболизм у мух.

Питательные вещества-зависимые эффекты

dilp2 -сверхэкспрессия

Мы также исследовали содержание белка на муху и обнаружили, что мухи с повышенной экспрессией dilp2 содержат больше белка, чем линии родительского контроля ( sd-Gal4 и UAS-dilp2 ), что позволяет предположить, что синтез белка повышен у . sd > dilp2 летает (рисунок 7).Интересно, что жизнеспособность мух с избыточной экспрессией dilp2 увеличивалась в зависимости от концентрации дрожжевых экстрактов в среде (фиг. 8A; коэффициент ранговой корреляции Спирмена = 0,79, p <0,0003). Относительная жизнеспособность самок мух с избыточной экспрессией dilp2 составляла только 2% в среде без дрожжевого экстракта, тогда как она составляла 16,6% в среде, содержащей 40 г / л дрожжевого экстракта. Кроме того, увеличение содержания белка в среде значительно увеличивало среднюю площадь крыла мух с избыточной экспрессией dilp2 , в то время как это не влияло на размер крыла контрольных мух (фиг. 9).Эти результаты показали, что для поддержки своего развития мухам с избыточной экспрессией dilp2 требуется больше белка в качестве питательного вещества, чем контрольным мухам. Возможно, что нехватка источников белка возникает у мух с повышенной экспрессией dilp2 . Чтобы проверить эту гипотезу, мы исследовали, происходит ли аутофагия в жировых телах, выделенных у личинок раннего третьего возраста. Большое количество положительных по аутофагии клеток наблюдали в жировых телах мух с избыточной экспрессией dilp2 , тогда как в жировых телах контрольных мух не было обнаружено никаких положительных по аутофагии клеток (фиг. 10).Повышение содержания белка в среде значительно подавляло аутофагию, опосредованную dilp2 , что позволяет предположить, что мухи с избыточной экспрессией dilp2 страдали от нехватки источников белка. А именно, нехватка источников белка может быть одной из причин полусмертности, вызванной dilp2 .

Рис. 7. Содержание белка у мух с повышенной экспрессией dilp2 . Содержание белка было значительно увеличено у мух со сверхэкспрессией dilp2 ( sd > dilp2 ) по сравнению с родительскими линиями ( sd-Gal4 и UAS-dilp2 ) в качестве контроля.Результаты показаны как среднее значение ± стандартная ошибка по крайней мере трех экспериментов. Стьюдент t -тест был проведен для анализа статистической значимости. ** p <0,01; *** р <0,001.

Рис. 8. Жизнеспособность мух с повышенной экспрессией dilp2 зависит от условий питания. Мух с избыточной экспрессией Dilp2 ( sd > dilp2 ) выращивали на средах, дополненных различными концентрациями дрожжевого экстракта (A) или глюкозы (B) .Относительную жизнеспособность мух с повышенной экспрессией dilp2 ( sd > dilp2 ) для каждой среды рассчитывали на основании количества контрольных братьев и сестер.

Рис. 9. Влияние богатой белком среды на размер крыла мух с повышенной экспрессией dilp2 . мух с повышенной экспрессией dilp2 ( sd > dilp2 ) выращивали на средах, дополненных различными концентрациями дрожжевого экстракта, и их размеры сравнивали с размерами крылышек мух внутреннего контроля.Средняя площадь крыла положительно коррелировала с концентрацией дрожжевого экстракта в среде. Стьюдент t -тест был проведен для анализа статистической значимости. * p <0,05.

Рис. 10. Интенсивная аутофагия у мух с повышенной экспрессией dilp2 . Жировые тельца выделяли из личинок ранней третьей стадии, сверхэкспрессирующих dilp2 ( sd > dilp2 ), и окрашивали LysoTracker Red DND-99 (A) .Когда мух выращивали на стандартной среде, содержащей 10 г дрожжей / л, сильные точечные сигналы (стрелки), соответствующие аутофагии, наблюдались у мух sd > dilp2 (верхняя правая панель), но не у родительских линий (). sd-Gal4 или UAS-dilp2 ) в качестве элементов управления (верхняя левая и средняя панели). Аутофагия не была обнаружена у мух sd > dilp2 , когда они были выращены на богатой белком среде, содержащей 40 г дрожжей / л (нижние панели).Пенетрантность (частота) эктопической аутофагии у sd > dilp2 мух (B) . Количество наблюдаемых образцов указано над каждой полосой.

Сверхэкспрессия dilp2 может вызывать хронический дефицит аминокислот. Чтобы изучить эту возможность, мы количественно определили количество свободных аминокислот у мух sd > dilp2 и sd > RFP с помощью ЖХ-МС / МС. Хотя относительные количества треонина и фенилаланина значительно различались между двумя группами, все изменения были незначительными и вряд ли повлияли на жизнеспособность (рис. 11).Эти результаты предполагают, что выжившие мухи с избыточной экспрессией dilp2 сохраняли нормальный аминокислотный гомеостаз, вероятно, хотя и вызывали эктопическую аутофагию. Однако, учитывая полусмертность животных, те, которые не смогли поддерживать гомеостаз аминокислот, могли умереть раньше во время развития.

Рис. 11. Содержание аминокислот у мух с повышенной экспрессией dilp2 . Количество свободных аминокислот A у взрослых мух определяли с помощью ЖХ-МС / МС в положительном режиме.Относительные количества каждой аминокислоты у мух sd > dilp2 были рассчитаны на основе таковых у мух sd > RFP в качестве контроля и показаны как среднее ± стандартная ошибка по крайней мере трех экспериментов с минимумом по пять мух в группе. Стьюдент t -тест был проведен для анализа статистической значимости. * p <0,05, ** p <0,01.

Соотношение белков и углеводов имеет решающее значение для выживания мух со сверхэкспрессией

dilp2

Возникновение аутофагии у мух с повышенной экспрессией dilp2 свидетельствует о том, что животные страдают от нехватки аминокислот.Было продемонстрировано, что соотношение белков и углеводов может влиять на продолжительность жизни и плодовитость мух (Lee et al., 2008). Возможно, что сверхэкспрессия dilp2 повлияла на оптимальное соотношение этих питательных веществ для развития мух. Таким образом, мы исследовали, может ли содержание глюкозы в корме для мух изменять полусмертность, вызванную dilp2 . Повышение концентрации глюкозы в среде значительно снижает жизнеспособность мух с избыточной экспрессией dilp2 , указывая на то, что сверхэкспрессия dilp2 увеличивает чувствительность к глюкозе.С другой стороны, снижение содержания глюкозы в среде значительно улучшило жизнеспособность мух с избыточной экспрессией dilp2 (рис. 8В, коэффициент ранговой корреляции Спирмена = -0,86, p <0,0001). Интересно, что мухи с повышенной экспрессией dilp2 , содержащиеся в условиях пониженного содержания глюкозы, росли значительно быстрее, чем мухи, выращенные на стандартных средах (фиг. 12). Средняя продолжительность (± стандартная ошибка) от яйца до ранней куколки составила 106,3 ± 1,3 и 82,6 ± 1,3 часа с контрольной средой и средой без глюкозы, соответственно (тест Стьюдента t : p <0.001). Эти результаты убедительно свидетельствуют о том, что диета с высоким содержанием белка и низким содержанием углеводов является оптимальной для жизнеспособности мух с повышенной экспрессией dilp2 .

Рис. 12. Мухи с повышенной экспрессией dilp2 развиваются быстрее в средах с пониженным содержанием глюкозы. Сверхэкспрессия dilp2 задерживает развитие мух, когда они выращиваются на стандартной среде, содержащей 100 г / л глюкозы (слева). Однако мухи развиваются быстрее, если их содержат в среде, лишенной глюкозы (справа).Средняя (± стандартная ошибка) продолжительность от яйца до ранней куколки составляла 106,3 ± 1,3 и 82,6 ± 1,3 часа с контрольной средой и средой, лишенной глюкозы, соответственно (тест Стьюдента t : p <0,001).

В этом исследовании мы продемонстрировали, что избыточная экспрессия dilp2 серьезно снижает жизнеспособность мух от яйца до взрослой особи и индуцирует высокую частоту эктопической аутофагии в жировых телах личинок раннего третьего возраста. Как и в клетках млекопитающих, недостаток питательных веществ вызывает аутофагию за счет ингибирования активности Tor у Drosophila (Scott et al., 2004). Однако аутофагия, зависящая от оверэкспрессии dilp2 , по-видимому, не регулируется понижающей регуляцией Tor, поскольку S6K, нижележащая мишень Tor, сильно активируется (Figure 2). Активированный S6K может выполнять аутофагию, поскольку экспрессия активированного S6K увеличивает вызванную голоданием аутофагию в отсутствие Tor у Drosophila (Scott et al., 2004). Возможно, что гиперактивация S6K у мух с избыточной экспрессией dilp2 может способствовать развитию аутофагии.В изолированных гепатоцитах крыс некоторые аминокислоты ингибируют индукцию аутофагии независимым от mTor (Tor млекопитающих) способом (Kanazawa et al., 2004). Следовательно, нехватка источников белка может напрямую вызывать аутофагию. Аутофагия, зависящая от гиперэкспрессии dilp2 , была возвращена с помощью диеты с высоким содержанием белка, что позволяет предположить, что условия питания являются критическими для выживания мух с избыточной экспрессией dilp2 . Было продемонстрировано, что мухи, выращенные на кормах, богатых питательными веществами, содержат значительно высокий уровень секретируемого dilp2 по сравнению с мухами, выращенными на кормах, лишенных питательных веществ, что указывает на то, что мухи могут ощущать доступность питательных веществ и соответственно регулировать секрецию своего инсулина (Geminard et al ., 2009). Наши результаты показывают, что избыточная передача сигналов инсулина / IGF ухудшает физиологию животных, что можно улучшить, контролируя пищевой баланс между белками и углеводами, по крайней мере, у мух.

Заявление о конфликте интересов

Авторы заявляют, что исследование проводилось при отсутствии каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могут быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

Благодарности

Мы благодарим Центр генетических ресурсов дрозофилы, Киото, Япония, и Фондовый центр Блумингтона за предоставленные запасы мух.Эта работа была поддержана специальным грантом Токийского столичного правительства Тоширо Айгаки.

Список литературы

Бишоф Дж., Маеда Р. К., Хедигер М., Карч Ф. и Баслер К. (2007). Оптимизированная система трансгенеза для дрозофилы с использованием интегразы phiC31, специфичной для зародышевой линии. Proc. Natl. Акад. Sci. США . 104, 3312–3317. DOI: 10.1073 / pnas.0611511104

Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

Brogiolo, W., Stocker, H., Икея, Т., Ринтелен, Ф., Фернандес, Р., и Хафен, Э. (2001). Эволюционно законсервированная функция рецептора инсулина дрозофилы и инсулиноподобных пептидов в контроле роста. Curr. Биол . 11, 213–221. DOI: 10.1016 / S0960-9822 (01) 00068-9

Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

Бротон, С., Алик, Н., Слэк, К., Басс, Т., Икея, Т., Винти, Г. и др. (2008). Уменьшение DILP2 у Drosophila определяет метаболический фенотип от продолжительности жизни, выявляя избыточность и компенсацию среди DILP. PLoS ONE 3: e3721. DOI: 10.1371 / journal.pone.0003721

Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

Бротон, С. Дж., Пайпер, М. Д., Икея, Т., Басс, Т. М., Якобсон, Дж., Дриг, Ю. и др. (2005). Увеличение продолжительности жизни, изменение метаболизма и стрессоустойчивость у дрозофилы в результате удаления клеток, вырабатывающих инсулиноподобные лиганды. Proc. Natl. Акад. Sci. США . 102, 3105–3110. DOI: 10.1073 / pnas.0405775102

Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

Эдвардс, К.Б., Копс, Н., Брито, А. Г., Кэнфилд, Дж., И Брэдшоу, П. К. (2013). Малат и фумарат увеличивают продолжительность жизни у Caenorhabditis elegans . PLoS ONE 8: e58345. DOI: 10.1371 / journal.pone.0058345

Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

Гао, X., Нойфельд, Т. П., и Пан, Д. (2000). PTEN дрозофилы регулирует рост и пролиферацию клеток посредством PI3K-зависимых и независимых путей. Dev. Биол . 221, 404–418. DOI: 10.1006 / dbio.2000.9680

Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

Gronke, S., Mildner, A., Fellert, S., Tennagels, N., Petry, S., Muller, G., et al. (2005). Липаза Браммера - эволюционно законсервированный регулятор накопления жира у дрозофилы. Ячейка Метаб . 1, 323–330. DOI: 10.1016 / j.cmet.2005.04.003

Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

Икея Т., Галич М., Белават П., Наирз К. и Хафен Э. (2002). Зависимая от питательных веществ экспрессия инсулиноподобных пептидов из нейроэндокринных клеток в ЦНС способствует регуляции роста у дрозофилы. Curr. Биол . 12, 1293–1300. DOI: 10.1016 / S0960-9822 (02) 01043-6

Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

Канадзава Т., Танейке И., Акаиси Р., Йошизава Ф., Фуруя Н., Фудзимура С. и др. (2004). Аминокислоты и инсулин регулируют аутофагический протеолиз посредством различных сигнальных путей в отношении mTOR в изолированных гепатоцитах крысы. J. Biol. Chem . 279, 8452–8459. DOI: 10.1074 / jbc.M306337200

Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

Ли, К.П., Симпсон, С. Дж., Клиссолд, Ф. Дж., Брукс, Р., Баллард, Дж. У., Тейлор, П. В. и др. (2008). Продолжительность жизни и размножение у дрозофилы: новые сведения из геометрии питания. Proc. Natl. Акад. Sci. США . 105, 2498–2503. DOI: 10.1073 / pnas.0710787105

Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

Лущак О.В., Господарев Д.В., Ровенко Б.М., Гловяк А.Д., Юркевич И.С., Клюба В.П. и др. (2012). Баланс между макроэлементами влияет на продолжительность жизни и функциональное старение у плодовой мухи Drosophila melanogaster . J. Gerontol. Биол. Sci. Med. Sci . 67, 118–125. DOI: 10.1093 / gerona / glr184

Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

Монтань, Дж., Стюарт, М. Дж., Стокер, Х., Хафен, Э., Козма, С. К., и Томас, Г. (1999). Киназа S6 дрозофилы: регулятор размера клеток. Наука 285, 2126–2129. DOI: 10.1126 / science.285.5436.2126

Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

Массельман, Л. П., Финк, Дж.Л., Нарзинский, К., Рамачандран, П. В., Хатирамани, С. С., Каган, Р. Л. и др. (2011). Диета с высоким содержанием сахара вызывает ожирение и инсулинорезистентность у дрозофилы дикого типа. Dis. Модель. Механика . 4, 842–849. DOI: 10.1242 / dmm.007948

Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

Олдхэм, С., Монтань, Дж., Радимерски, Т., Томас, Г., и Хафен, Э. (2000). Генетическая и биохимическая характеристика dTOR, гомолога дрозофилы мишени рапамицина. Гены Дев . 14, 2689–2694. DOI: 10.1101 / gad.845700

Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

Скотт Р. К., Шульдинер О. и Нойфельд Т. П. (2004). Роль и регуляция аутофагии, вызванной голоданием, в жировом теле дрозофилы. Dev. Cell 7, 167–178. DOI: 10.1016 / j.devcel.2004.07.009

Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

Скороход А., Гамулин В., Гундакер Д., Кавсан В., Мюллер И.М., и Мюллер, В. Э. (1999). Происхождение тирозинкиназ, подобных рецептору инсулина, у морских губок. Biol. Бык . 197, 198–206. DOI: 10.2307 / 1542615

Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

Скорупа, Д. А., Дервисефендик, А., Цвинер, Дж., И Плетчер, С. Д. (2008). Состав рациона определяет потребление, ожирение и продолжительность жизни Drosophila melanogaster . Ячейка старения 7, 478–490. DOI: 10.1111 / j.1474-9726.2008.00400.х

Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

Stocker, H., Andjelkovic, M., Oldham, S., Laffargue, M., Wymann, M.P., Hemmings, B.A., et al. (2002). Жизнь с летальными уровнями PIP3: жизнеспособность мух, лишенных PTEN, восстанавливается мутацией домена PH в Akt / PKB. Наука 295, 2088–2091. DOI: 10.1126 / science.1068094

Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

Цуда, М., Кобаяси, Т., Мацуо, Т., и Айгаки, Т.(2010). Фермент, разлагающий инсулин, противодействует инсулинозависимому росту тканей и нейротоксичности, вызванной Abeta, у Drosophila. FEBS Lett . 584, 2916–2920. DOI: 10.1016 / j.febslet.2010.05.010

Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

Xu, X., Gopalacharyulu, P., Seppanen-Laakso, T., Ruskeepaa, A. L., Aye, C. C., Carson, B.P., et al. (2012). Передача сигналов инсулина регулирует катаболизм жирных кислот на уровне активации КоА. PLoS Genet .8: e1002478. DOI: 10.1371 / journal.pgen.1002478

Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

Зависящий от опыта резонанс в амигдало-корковых цепях поддерживает восстановление памяти о страхе после исчезновения.

Животные Комитет по уходу и использованию. Мыши

PV-Cre (возраст 2–6 месяцев), использованные в этом исследовании, были гетерозиготными по локусу нокаута PV-IRES-Cre (B6; 129p2- Pvalb tm1 (cre) Arbr / J) .Использовались как самки, так и самцы мышей, и их данные были объединены для окончательного анализа. Мыши получали пищу и воду ad libitum и находились в социальном жилье до начала поведенческих экспериментов, то есть в возрасте не менее 10 недель. Мышей держали в обычном режиме свет-темнота, и все эксперименты проводились во время светлой фазы.

Стереотаксическая хирургия

Мышей анестезировали изофлураном, помещали в стереотаксический аппарат (Kopf) и вводили вирус. После инъекции иглу оставляли на 10 мин, а затем медленно втягивали.Разрез зашивали, мышей взвешивали и наблюдали за выздоровлением. Для экспериментов по оптогенетической стимуляции BLA 250 нл AAV-Syn-DIO-ChR2-mCherry или AAV-Ef1a-DIO-hChR2 (h234R) -mCherry (UNC Vector Core, Karl Deisseroth) вводили в BLA (AP - 1,35, ML ± 3,45, ДВ - 5,15 мм). Большинству мышей в этом эксперименте вводили односторонние инъекции, за исключением пяти мышей, которым были нацелены двусторонние. Данные от односторонних и двусторонних мышей были объединены для окончательного анализа, поскольку аналогичные эффекты наблюдались в обеих группах.

Мышам имплантировали волоконно-оптические канюли через 2–3 недели после инъекции вируса (Thorlabs, CFM12L05) в BLA (AP - 1,35, ML ± 3,45, DV -5 мм). Во время этой операции мышам, которым требовалась запись LFP, имплантировали электроды (вольфрамовая проволока с покрытием PFA; системы AM) в BLA (AP - 1,35, ML ± 3,45, DV -5 мм) и mPFC (AP + 1,75, ML ± 0,3 , DV −2 мм). Два электрода были прикреплены к заранее изготовленным головным креплениям (Pinnacle; # 8201). Подголовники были прикреплены к черепу винтами из нержавеющей стали, которые также действуют как эталонные электроды ЭЭГ и заземляющие электроды, помещенные в мозжечок.Головные крепления были подключены к 100-кратному предусилителю (Pinnacle; 8202-SE). Для фиктивных операций мышам имплантировали оптические канюли идентичным образом, но без экспрессии ChR2 (либо из-за отсутствия вирусной инъекции, либо из-за отсутствия трансгена PV-Cre ).

Для экспериментов, включающих стимуляцию как BLA, так и PFC, были выполнены те же процедуры, что и выше, но с инъекциями и волоконными имплантатами, сделанными с двух сторон в BLA и PFC (AP + 1,75, ML ± 0,3, DV для вируса -2.3 мм, DV для волокна −2 мм), и электроды, односторонне имплантированные в правый BLA / PFC (те же координаты, что и оптическое волокно).

Поведение

Поведение началось через 1 неделю после имплантации волокон и электродов и как минимум через 3 недели после инъекции вируса. Ни у одной из мышей не проводились предварительные процедуры или испытания, и мышей случайным образом распределяли в экспериментальные группы. Мышей подвергали контекстуальному кондиционированию страха, состоящему из трех тренировочных испытаний (FC1, FC2 и FC3) с 3-часовым перерывом между каждым испытанием.Общая продолжительность каждого тренировочного испытания составляла 500 с. Обучающее испытание началось с помещения мыши в квадратную камеру с решетчатым полом (контекст A; Coulbourn Instruments; h20-11RTC). Через 240, 300, 360 и 420 с был нанесен удар по стопе (2 с и 0,70 мА). На 2 и 3 дни (или 4 и 5 для группы отсроченного исчезновения) мышей подвергали максимум четырем испытаниям на исчезновение в день. Пост-FC извлечение было выполнено в начале первого испытания исчезновения. Каждое испытание на вымирание длилось 1200 с, с интервалом между испытаниями 2 часа.Для каждого испытания по вымиранию мышей помещали в тот же ящик, который использовался для кондиционирования страха, без ударов ногами. Обучение исчезновению заканчивалось либо после 8 испытаний, либо когда животное показывало уровни замерзания <20% в начале испытания вымирания, в зависимости от того, что наступит раньше. Это было сделано для того, чтобы избежать потенциального эффекта пола после обучения угасанию, чтобы мы могли адекватно оценить возможные эффекты оптической стимуляции, снижающие замерзание. После вымирания (на 4-й день для группы стандартного вымирания и на 6-й день для группы отсроченного вымирания) мышей тестировали в течение 240 с во время одного теста поиска в контексте A.Если замораживание во время этого испытания превышало 50% уровней замораживания Post-FC, что указывало на неадекватное обучение вымиранию, данные из этого испытания по извлечению отбрасывались, и испытание по извлечению было выполнено снова на следующий день с идентичными параметрами. После испытания по извлечению из контекста A и в тот же день мыши прошли 240-секундное испытание по извлечению в контексте B, которое состояло из квадратного пластикового ящика с подстилкой, опрысканной 10% уксусной кислотой, и полосатыми стенками.

Оптическая стимуляция in vivo

Протокол аналоговой синусоидальной стимуляции с частотой 4 Гц и 8 Гц был разработан в программном обеспечении LabChart (за исключением раздела «Запись и анализ отдельных и нескольких единиц измерения in vivo») и пропущен через лазер ( Laserglow, LRS-0473 DPSS Laser).В эксперименте с двойной стимуляцией BLA + mPFC (рис.7) два отдельных лазера контролировали стимуляцию BLA и mPFC, так что один лазер стимулировал либо синфазно (синфазное состояние), либо с фазовым сдвигом на 180 градусов относительно к другому лазеру (противофазное состояние). Выходная мощность лазера на вершине световода на пике синусоиды составляла ~ 10 мВт. Оптическая стимуляция проводилась во время первого испытания по исчезновению, пробного поиска в контексте A и испытания в контексте B. Кроме того, во время первого испытания кондиционирования страха выполняли оптическую стимуляцию, чтобы приучить мышей к внезапному появлению света.Во всех испытаниях оптическая стимуляция выполнялась в течение четырех 30-секундных интервалов (40–70 с, 90–120 с, 140–170 с и 180–210 с). Эти четыре периода стимуляции чередовались между 4 Гц и 8 Гц или синфазными и противофазными. Для каждого животного порядок стимуляции был одинаковым во всех испытаниях, но порядок варьировался (4-8-4-8 против 8-4-8-4; in-anti-in-anti vs. anti-in-anti -in) у животных, чтобы гарантировать отсутствие эффектов, зависящих от порядка.

Количественная оценка замораживания

Замерзание регистрировали с помощью цифровой камеры, подключенной к компьютеру с программным обеспечением Actimetrics FreezeFrame.Поведение при замораживании было количественно оценено человеком-наблюдателем, поскольку количественная оценка с использованием программного обеспечения была невозможна из-за влияния световой стимуляции на автоматический анализ видео. Количественная оценка замораживания была проведена людьми, не имеющими отношения к плану эксперимента и порядку стимуляции. Баллы замораживания без света рассчитывались в те эпохи, когда свет был выключен (от 0-40 с и 210-240 с), а баллы замораживания при оптической стимуляции рассчитывались во время стимуляции с частотой 4 и 8 Гц (каждые 2x 30 с на поведенческое испытание).Все замораживания боя продолжительностью более 0,5 с были включены в количественную оценку (за исключением анализа коротких и длинных схваток с замораживанием и корреляции продолжительности боя с CPS), когда включались только схватки продолжительностью более 1,9 с).

Электрофизиология in vitro

После декапитации под изофлурановой анестезией мозг быстро извлекали из черепа и помещали в ледяную искусственную спинномозговую жидкость (aCSF), насыщенную 95% O2 и 5% CO2 и содержащую 2 мМ Mg2 + и 1 мМ Са2 +. Коронковые срезы (350 мкм), содержащие миндалевидное тело и приблизительно охватывающие Bregma от -1 до -2.5 мм, были получены с помощью вибратома Leica VT1200s, инкубировали 35 минут при 33 ° C в 1,5 мМ Mg2 + и 2 мМ Ca2 + -содержащем aCSF, а затем дали возможность восстановиться в течение 45 минут при комнатной температуре. Затем срезы переносили в записывающую камеру, где их перфузировали cSF (~ 2 мл / мин), насыщенным 95% O2 / 5% CO2, при 34 ° C (регулятор температуры TC344B Warner instrument Co.). Состав aCSF был (в мМ): 120 NaCl, 3,2 KCl, 1 Nah3PO4, 26 NaHCO3 и 10 глюкозы (pH 7,3, 290-300 мОсм · л-1). mCherry-позитивные интернейроны ЛВ идентифицировали с помощью флуоресцентного микроскопа Nikon (Eclipse FN-1).Их накладывали с помощью инфракрасной камеры и системы ДИК (DAGE-MTI) под объективом × 16. Пипетки для записи патч-зажим (3–6 МОм) заполняли раствором глюконата калия, содержащим (в мМ): 130 K + -глюконат, 2 KCl, 10 HEPES, 3 MgCl2, 2 K-ATP, 0,2 Na-GTP, 5 фосфократин. ди, трис (pH 7,3, 290 мОсм · л-1). Клетки с сопротивлением доступа> 25 МОм были немедленно выброшены. Записи с фиксацией положения целых клеток получали в режиме фиксации тока, и клетки поддерживали при их мембранном потенциале покоя на всем протяжении (Iinj = 0 пА).Оптическая стимуляция доставлялась из лазерной системы DPSS с длиной волны 430/490 нм (LaserGlow) через оптическое волокно, помещенное в ванну непосредственно над срезом и соединенное мостиковым кабелем (400 мкм, 0,39 NA, Thorlabs). Перед экспериментами мощность света измерялась на конце оптического волокна. Лазер управлялся аналоговым генератором сигналов Agilent 33,210 A, также подключенным к аналоговому входу Digidata 1322A для автономного анализа и подающего аналоговые синусоидальные стимулы с желаемой частотой (Vpp 1 В; смещение 0 В).Выходная мощность лазера и частота стимуляции формы волны переключались вручную между стимуляциями. Каждая клетка подвергалась стимуляции с частотой 4 Гц и 8 Гц (с интервалом не менее 30 с) при возрастающей мощности света 1, 10, 75, 220, 375 и 400 мкВт, по крайней мере, один раз в течение 15–30 минут. запись. Данные записывались с помощью усилителя Multiclamp 700B (Axon Instruments, Inc.) через Digidata 1322A, дискретизировались с частотой 20 кГц, фильтровались с частотой 10 кГц и анализировались с использованием программного обеспечения pClamp10 (Axon Instruments, Inc.).

Регистрация и анализ LFP in vivo

Электрофизиологическая активность была получена с использованием системы Powerlab Labchart (инструменты ADI) на частоте 4 кГц. Данные были проанализированы с использованием пользовательских сценариев MATLAB, использующих функции, доступные в наборах инструментов Fieldtrip и EEGLAB. Необработанные LFP были подвергнуты понижающей дискретизации до 1000 Гц и полосовой фильтрации от 0,7 до 300 Гц. Спектральный анализ проводился с применением метода конуса Хеннинга с окнами 1,5 с и 95% перекрытием. Перекрестный спектр мощности ( CPS ) был рассчитан как среднее абсолютное значение перекрестного спектра \ (({S _ {{\ mathrm {xy}}}) \) между BLA и PFC: \ (CPS = \ frac {{{\ mathrm {\ Sigma}} \ left | {S _ {{\ mathrm {xy}}}} \ right |}} {N} \).Когерентность ( coh ) и мнимая когерентность ( iCoh ) между LFP BLA и PFC рассчитывалась как:

$$ coh _ {{\ mathrm {xy}}} = \ frac {{\ left | {{\ sum} {S _ {{\ mathrm {xy}}}}} \ right |}} {{\ sqrt {\ mathop {\ sum} \ nolimits S _ {{\ mathrm {xx}}} \ times \ mathop {\ sum} \ nolimits S _ {{\ mathrm {yy}}}}}} \; \; \; \; \; \; iCoh _ {{\ mathrm {xy}}} = \ frac {{\ left | {imag \ left ({\ mathop {\ sum} \ nolimits S _ {{\ mathrm {xy}}}} \ right)} \ right |}} {{\ sqrt {\ mathop {\ sum} \ nolimits S _ {{ \ mathrm {xx}}} \ times \ mathop {\ sum} \ nolimits S _ {{\ mathrm {yy}}}}} $$

Все спектры мощности, перекрестной мощности и когерентности были количественно определены как отношение 3–6: 6–12 Гц область под кривой (в тексте обозначается как «Соотношение мощности / перекрестной мощности / когерентности 4: 8 Гц») с использованием GraphPad Prism.

Для анализа периодов стимуляции, CPS и спектры когерентности для каждого условия стимуляции для каждой мыши рассчитывали из двух периодов стимуляции (или отсутствия света) в каждом испытании. Для анализа показателей CPS или когерентности по состояниям памяти использовались LFP из периодов отсутствия света во время каждого испытания. Для анализа разности фаз между PFC и BLA, LFP сначала подвергались полосовой фильтрации до 3–5 Гц для колебаний 4 Гц и 7–9 Гц для колебаний 8 Гц. На основе преобразования Гильберта этих сигналов были вычислены мгновенные фазы в каждый момент времени.Разность фаз рассчитывалась как \ ({\ mathrm {phase}} _ {{\ mathrm {PFC}}} - {\ mathrm {phase}} _ {{\ mathrm {BLA}}}} \).

Для анализа коротких и длинных замораживаний была включена каждая мышь с как минимум двумя короткими (2–3,5 с) или двумя длинными (> 3,5 с) периодами замораживания. Затем рассчитывали CPS с использованием первых двух секунд этих приступов и усредняли для каждой мыши.

Одно- и многоэлементные записи и анализ in vivo

Изготовленные на заказ оптотетроды, скрученные из четырех 12,7 мкм твердых никель-хромовых проволок с покрытием PAC (Sandvik, FL).Для каждой мыши использовался напечатанный на 3D-принтере привод тетрода (прочная смола) для размещения до восьми тетродов 70,71,72 . Каждый провод тетрода был прикреплен к интерфейсной плате электродов (32 канала EIB с разъемом Omnetics, Open-Ephys) с помощью контакта EIB (большой контакт, Neuralynx). Затем тетроды прикрепляли к оптическому волокну 200 мкм (керамические канюли, Thorlabs или RWD) с помощью суперклея (Loctite). Тетроды были вырезаны под углом 45 градусов на 300–500 мкм ниже кончика волокна, так что каждый тетрод имел разную длину.Тетроды покрывали золотом (Gold Non-Cyanide solution, Sifcoasc) для уменьшения импеданса электрода до 250 кОм при 1 кГц (nanoZ, Plexon). Тетроды имплантировали в BLA, как описано выше (см. «Стереотаксическая хирургия»). Мышам давали возможность восстановиться в течение 1 недели, и за это время они привыкли к манипуляциям с ними. Электролитическое поражение выполняли перед рассечением мозга, чтобы отметить положение кончика электрода, путем введения 30-секундного постоянного тока 30 мкА в каждый выбранный штифт EIB (изолятор стимула A365, WPI).

Поведенческий протокол такой же, как описано выше, за исключением того, что в общей сложности выполнялась 4-минутная синусоидальная оптическая стимуляция (восемь 30-секундных периодов стимуляции, чередующиеся между 4 Гц и 8 Гц) на поведенческое испытание, чтобы увеличить выборку потенциала изредка. -шпиндельные агрегаты. Кроме того, 30 минут стимуляции опто-тегированием (прямоугольные импульсы 15 мс, 0,5 Гц) выполняли в нейтральном контексте после завершения проб по извлечению в последний день.

Многоканальные нейронные сигналы были записаны, усилены и оцифрованы с помощью платы усилителя RHD2132 (32 униполярных канала с 3-осевым акселерометром, Intan Technologies), которая контролировалась платой Open-Ephys Acquisition Board 73 .Необработанные данные были дискретизированы с частотой 30 кГц и полосовой фильтрацией от 0,3 до 8850 Гц. Для онлайн-обнаружения всплесков необработанные данные дополнительно подвергались полосовой фильтрации в диапазоне от 700 до 7000 Гц, а пороговое значение амплитуды всплесков сигналов для каждого канала было выбрано вручную, чтобы гарантировать обнаружение большинства всплесков. Написанные на заказ сценарии Matlab использовались для управления аналоговым световым рисунком 473-нм DPSS-лазера (Laserglow Technologies) через USB-устройство сбора данных (USB-1208FS-Plus, Measurement Computing Corporation).Аналоговая световая волна, маркеры событий, связанных с поведенческой парадигмой, были записаны Open-Ephys.

Пики были обнаружены онлайн и отсортированы в автономном режиме. Для анализа единичных единиц полуавтоматическая кластеризация пиковых сигналов была выполнена с использованием KlustaKwik (K. Harris) и MClust-4.0 (A.D. Redish) на основе характеристик формы сигнала Energy, Valley и wavePC1. Затем кластеры были вручную уточнены для выделения отдельных единиц на основе форм сигналов, автокоррелограммы, гистограммы межпикового интервала (ISI) и показателей качества кластера (расстояние изоляции (ID) и L-отношение) 74 .Кластеры с L-отношением <0,5, ID> 12 и <0,5% ISI короче 2 мс были классифицированы как единичные (для всех единичных кластеров медиана L-отношения составляла 0,07, медиана ID равнялась 23, и средний процент ISI <2 мс составлял 0,1%). Для анализа мульти-единиц все спайки, обнаруженные одним тетродом, считались одним MUA.

Для анализа синхронизации блоков BLA с эндогенными колебаниями 4 Гц и 8 Гц мы проанализировали испытание непрерывного угасания, во время которого наблюдаются колебания 4 Гц и 8 Гц, когда мыши чередуются между замораживанием и незамерзанием.Это позволило нам следить за активностью одних и тех же единиц в обоих случаях поведения. Чтобы гарантировать достаточный объем выборки, для каждого состояния / мыши анализировался период 350–600 с. Сила синхронизации спайка-LFP оценивалась путем расчета меры попарной фазовой согласованности (PPC) с использованием набора инструментов Fieldtrip в Matlab 75,76 . Вкратце, для каждой заданной частоты ( f ) фаза каждого всплеска относительно LFP была определена путем вырезания длительности эпохи LFP 5/ f LFP, которая затем была сужена по окну Хеннинга и преобразована Фурье.Чтобы избежать спайкового загрязнения PPC, LFP каналов, из которых было обнаружено устройство, были исключены. Для каждого блока окончательная цена за клик - это среднее значение по каналам LFP. Чтобы свести к минимуму изменчивость в оценке PPC (Винк и др. 75 ), единицы, у которых не было по крайней мере 90 всплесков в течение анализируемого периода времени, были исключены. Чтобы проверить статистическую значимость PPC, мы выполнили перестановочное тестирование для каждого блока на каждой частоте в диапазоне 3–12 Гц. Сигнал LFP был разрезан на сегменты продолжительностью 1 с, которые затем случайным образом перетасовывались для генерации суррогатного эталонного LFP.Для каждой итерации рандомизации ( N = 100) PPC рассчитывалась для каждой частоты от 3 до 12 Гц, что составляло эталонное распределение для статистического теста. Затем мы определили, находится ли тестируемое значение выше 95-го процентиля эталонного распределения, и в этом случае мы посчитали, что устройство существенно синхронизировано по фазе с заданной частотой. Блоки, которые существенно синхронизированы по фазе до 3–5 Гц или 7–12 Гц, были классифицированы как устройства с фазовой синхронизацией до 4 Гц или 8 Гц, соответственно.Некоторые устройства показали значительную фазовую синхронизацию в обоих частотных диапазонах или ни в одном из них и были классифицированы как таковые. Сравнивая эту классификацию для каждого блока в периоды замораживания и незамерзания, мы определили блоки, которые синхронизированы по фазе исключительно на 4 Гц или 8 Гц, а также те, которые переключаются.

Для анализа активности одиночных пиков BLA во время стимуляции 4 Гц и 8 Гц было проанализировано в общей сложности 120 с на каждую частоту стимуляции (периоды стимуляции 4 × 30 с на частоту стимуляции, как описано выше).Фазовая синхронизация по форме волны стимула для каждого блока с по меньшей мере 30 пиками была проанализирована путем вычисления PPC по форме волны стимула и проверки значимости, чтобы можно было классифицировать блоки как со значительной фазовой синхронизацией для стимуляции 4 Гц или 8 Гц или нет. Предпочтение фазовой синхронизации этих же единиц во время эндогенной активности также было проанализировано путем расчета PPC на LFP, только для тех единиц с по крайней мере 70 спайками во время замораживания и незамерзания (в периоды отсутствия стимуляции).Это предпочтение фазовой синхронизации было определено количественно как отношение площади под кривой спектров PPC между полосой 4 Гц (3–6 Гц) и полосой 8 Гц (6–12 Гц; на рисунках обозначается как «4 : Коэффициент PPC 8 Гц ').

Аналогичным образом, для анализа фазовой синхронизации BLA MUA во время стимуляции 4 Гц и 8 Гц, те же 120 с периода стимуляции были проанализированы как для испытаний поиска «страх + угасание памяти», так и «без памяти». PPC к текущему LFP рассчитывалась и количественно определялась как «соотношение PPC 4: 8 Гц» для каждого MUA, как описано выше.

Гистологический анализ

Мышей глубоко анестезировали и внутрисердечно перфузировали 0,1 М фосфатным буфером (PB), а затем 4% параформальдегидом (PFA 4%), растворенным в 0,1 M PB. Мозги извлекали и постфиксировали в PFA 4% в течение 24 часов. Мозг переносили на 30% сахарозу на 48–72 ч перед тем, как срезать 30-мкм корональные срезы всего мозга с помощью криостата. Срезы хранили в фосфатно-солевом буфере (PBS) с 0,025% азидом натрия при 4 ° C до использования. Для иммунофлуоресцентного окрашивания срезы блокировали на 1 ч при комнатной температуре в PBS-T (PBS с 0.25% Triton X-100) с 8% нормальной козьей сывороткой. Срезы инкубировали в мышиных анти-PV (Millipore MAB1572; моноклональные; 1: 2000) при 4 ° C в течение 48–72 часов. Вторичное антитело (ThermoFisher, козье антимышиное антитело Alexa Fluor 488, 1: 1500) разводили в блокирующем растворе и затем наносили на срезы на 1 час при комнатной температуре с последующими тремя полосканиями в течение 15 минут в PBS-T. Срезы помещали на предметные стекла и закрывали покровным стеклом. Эпифлуоресцентный микроскоп с широким полем (Keyence BZ-X700) использовался для получения изображений для проверки электродов и места инъекции.Изображения были получены с увеличением 10–20 × и сшиты вместе с использованием программного обеспечения Keyence. Конфокальный лазерный сканирующий микроскоп (Leica SPE) использовался для получения изображений для анализа перекрытия mCherry / PV.

Для анализа экспрессии ChR2-mCherry в грушевидной коре с помощью ImageJ была определена средняя интенсивность флуоресценции mCherry в BLA и грушевидной коре. Затем каждое значение нормализовали к уровню фоновой флуоресценции в том же разделе (средняя интенсивность флуоресценции в прилегающей / соматосенсорной коре).Уровень экспрессии ChR2-mCherry в грушевидной коре был рассчитан как процент нормализованной средней интенсивности флуоресценции в грушевидной коре относительно таковой в BLA (отдельно рассчитывается приблизительно для восьми секций на мышь с последующим вычислением среднего процента для каждой мыши) .

Статистический анализ

Статистические тесты были выполнены с использованием Prism (GraphPad) и указаны в подписях к рисункам. Все статистические тесты были двусторонними. Все планки погрешностей и заштрихованные области на графиках представляют собой стандартную ошибку средних значений (SEM).

Исключение мышей из анализа

Мышей исключали из всех анализов (поведенческих и электрофизиологических), если у них была недостаточная экспрессия ChR2-mCherry в BLA / mPFC или если экспрессия не была нацелена на BLA / mPFC. Мышей исключали из электрофизиологического анализа, если электроды размещались за пределами целевой области (BLA / mPFC), или если записи были загрязнены шумом, таким как артефакты движения, или если не было обнаружено заметных колебаний 4 Гц после кондиционирования страха; из этих мышей подгруппу включали только для анализа поведения, если нацеливание вируса и оптических волокон было правильным.Исключение мышей определяли без учета экспериментальных условий.

Краткое изложение отчета

Дополнительная информация о дизайне исследования доступна в Резюме отчета об исследовании природы, связанном с этой статьей.

независимый - определение и значение

  • Новая программа отводит большую роль полунезависимой комиссии по ядерной безопасности , а не отдельному регулирующему органу в ядерной сфере, находящемуся под контролем отраслевого министерства.

    Япония внедряет программу стресс-тестов для атомных станций

  • В Багдаде Айяд Аллави, бывший премьер-министр шиитов, возглавляющий в правительстве контингент, состоящий в основном из суннитов, встретился со своей группой Иракийя, чтобы обсудить способы облегчить положение г-наМалики отказался от своей роли, в то время как курдские лидеры встретились в Эрбиле, столице полунезависимого курдского региона, с той же целью.

    Политические лидеры Ирака ищут беглеца Малики

  • Почтовая служба

    - это полунезависимое федеральное агентство , которому поручено обеспечивать нейтральный доход.

    Думайте о прогрессе »Коркер и Александр держат законопроект о финансировании авиации, чтобы помешать водителям FedEx объединяться в профсоюзы

  • Идзама говорит, что есть аналогичные проблемы с полицейскими службами и даже с управлением другими государственными структурами, которые занимаются безопасностью: «Более серьезная проблема здесь в том, что у вас есть 14 полунезависимых разведывательных и вооруженных подразделений в стране, а также юридическое прикрытие. под которыми они действуют, сомнительно », - говорит он.

    Угандийская полиция и военное подразделение обвиняются в пытках

  • Смерть г-на Кано может создать серьезные проблемы с преемственностью для партизан, которые сгруппированы в десятки полунезависимых «фронтов» или частей по всей стране.

    Должностные лица Колумбии заявили, что главный лидер ФАРК убит в результате взрыва бомбы

  • Если вы посмотрите на общий план этого интерьера, вы заметите, что комната с кроватью соединена с другим полунезависимым пространством , создавая комбо спальни и гостиной, которое мы находим весьма интересным.- через Design De Interior

    Бело-черный коврик

  • Он проделал некоторую работу по продвижению прав человека и полунезависимых СМИ, но встретил сопротивление старой гвардии в революционных комитетах и ​​службах безопасности.

    Лидер Ливии Муаммар Каддафи не оставит очевидного преемника, если уйдет

  • Но несколько суннитских политиков пытаются убедить могущественных курдов, которые управляют своей собственной полунезависимой администрацией на севере, базирующейся в городе Эрбиль, а также образуют третью по значимости фракцию в правительстве, возглавляемом Малики, к сотрудничать с ними в изгнании г.

  • Добавить комментарий

    Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *