ООО «Центр Грузовой Техники»

8(812)244-68-92

Содержание

Нелюбимая полицией система подвески Suspension Bose

Как мы знаем, в задачи подвески входит две функции — комфорт ездокам и надежность на дороге. К сожалению, эти две функции в современных конструкциях подвесок взаимоисключают друг друга. Комфортная подвеска, обеспечивающая плавность раскачки кузова, точно также моментально реагирует при поворотах или проезде неровностей, снижая устойчивость кузова. Жесткая же подвеска, наоборот, не дает раскачиваться кузову, но создает зубодробильный эффект находящимся в салоне.

Новая разработка корпорации Bose заключается в том, что подвеска регулируется при проезде неровностей или в поворотах электромагнитным двигателем. Суть метода состоит в том, что у каждого колеса вместо амортизатора и пружины смонтирован линейный электромагнитный мотор. Внутри мотора находятся магниты и соленоид.

Система подвески Suspension Bose.

На снимке вы видите: слева изменение положения кузова при реагировании обычной (неспортивной) подвески на выполнение различных маневров и проезд неровностей; справа — положение кузова при работе в тех же обстоятельствах электромагнитной подвески Suspension Bose.

Когда ток протекает по обмотке внутри катушки (соленоида), создается магнитное поле, в результате чего мотор работает на сжатие и отбой. Одним из преимуществ электромагнитного двигателя является быстродействие. Он эффективно противодействует ухабам, рытвинам и выбоинам, сохраняя комфорт для пассажиров. Разработчики этого новшества тестировали подвеску на реальных серийных автомобилях в различных ситуациях — поворотные маневры на различных скоростях, старт-торможение, проезд неровностей. По всем показателям Suspension Bose позволила объединить ранее несовместимое — устойчивость кузова с комфортом ездоков.

По сути дела, неровности до 5-7 см в глубину или высоту (и даже до 10-15 взависимости от диаметра колеса) не создают эффекта раскачки кузова. Подвеска за счет оперативной работы электромоторов как-бы поджимает колеса в случае проезда ямок или ухабов. Более того, при внедрении подобной технологии в серийное производства может возникнуть один существенный казус — автомобилю с Suspension Bose нет необходимости притормаживать при проезде «лежачего полицейского».

Ходят слухи, что именно это обстоятельство спровоцировало торможение внедрения электромагнитной подвески в серийное производство автомобилей. В частности, полицейские департаменты Германии и Австрии пригрозили запретом на эксплуатацию автомобилей с такой подвеской на территориях своих стран. Впрочем, законопослушным туристам, предпочитающим приобретать выгодные туры в австрию, до этих проблем нет никакого дела. Главное, что на дорогах Австрии все соблюдают ПДД корректность при движении.

Видео, рекламирующее работу подвески Suspension Bose.

electromagnetic suspension — это… Что такое electromagnetic suspension?

  • electromagnetic susceptibility
  • electromagnetic switch

Смотреть что такое «electromagnetic suspension» в других словарях:

  • Active suspension — Active or adaptive suspension is an automotive technology that controls the vertical movement of the wheels with an onboard system rather than the movement being determined entirely by the road surface.

    The system virtually eliminates body roll… …   Wikipedia

  • Codes for electromagnetic scattering by spheres — this article list codes for electromagnetic scattering by a homogeneous sphere, layered sphere, and cluster of spheres. Some of the source codes may be available on [1]. Contents 1 Solution techniques 2 Classification …   Wikipedia

  • Maglev — JR Maglev at Yamanashi, Japan test track in November 2005 …   Wikipedia

  • Maglev (transport) — MAGLEV, or magnetic levitation, is a system of transportation that suspends, guides and (usually) propels vehicles, predominantly trains, using magnetic forces. This method has the potential to be faster, quieter and smoother than wheeled mass… …   Wikipedia

  • Magnetic levitation — This article is about magnetic levitation. For trains based on this effect, see Maglev. For the Ruby interpreter, see MagLev (Ruby interpreter). Levitating pyrolytic carbon Magnetic levitation, maglev, or magnetic suspension is a method by which… …   Wikipedia

  • Bose Corporation — Infobox Company company name = Bose Corporation company company type = Private company slogan = Better Sound Through Research foundation = 1964 location = Framingham, Massachusetts key people = Amar Bose, Chairman, Founder Bob Maresca, President… …   Wikipedia

  • Magnetic bearing — A magnetic bearing A magnetic bearing is a bearing which supports a load using magnetic levitation. Magnetic bearings support moving machinery without physical contact, for example, they can levitate a rotating shaft and permit relative motion… …   Wikipedia

  • Ventricular assist device — Graphic describing a Left Ventricular Assist Device (LVAD). The device pumps blood from the left ventricle to the aorta. A Ventricular assist device, or VAD, is a mechanical circulatory device that is used to partially or completely replace the… …   Wikipedia

  • EMS — or Ems may refer to:Organizations* Eastern Mountain Sports, an outdoor retailer * Edinburgh Mathematical Society, a Scottish Mathematical Society * Electronic Music Studios (London) Ltd, a manufacturer of synthesizers * Eitzen Maritime Services,… …   Wikipedia

  • EMS (значения) — Эта статья содержит незавершённый перевод с иностранного языка. Вы можете помочь проекту, переведя её до конца. Если вы знаете, на каком языке написан фрагмент, укажите его в этом шаблоне. EMS или Ems может обозначать …   Википедия

  • Electromagnet — An electromagnet is a type of magnet in which the magnetic field is produced by the flow of electric current. The magnetic field disappears when the current is turned off. Electromagnets are widely used as components of other electrical devices,… …   Wikipedia

Список всех постов / smotra.ru

личный блог Эрик Давидыч →
Всем быть! SMOTRA.RU — самый центр автомобильного движения России (Портал владельцев крутых тачек и тех, кто им завидует) Первым делом тачки!

Сегодня многие могут позволить себе крутой сайт, но мало кто может позволить себе крутую тачку. Мы решили позволить себе и первое и второе!

Началось все с того, что мы до

29 Май 2009 в 23:00

3703

личный блог epicfail →
Первый день проекта Наконец этот день настал. Мы запускаем наш проект!
Естественно впереди ещё много работы, т.к. осталась куча нереализованных идей, но основной функционал сделан, так что велкам!

Будем рады любым комментариям. Регистрируйтесь, добавляйте автомобили, пишите в блогах и объединяйтесь в команды. О всех ошиб

30 Май 2009 в 21:49

678

личный блог Max Sergeevich →
Дилема Выбора Ну если будут граматические ошибки знайте по русскому у меня 3,написать вот что хотел,так как на права уже сдаю,то и надо машину,а то нахуй мне эти права,насчет всяких бюджетов писать не люблю,но сразу скажи что пока выбираю между М3 только купе и Мэрсом С63 AMG,на тэст драйв пока не дадут,придется

30 Май 2009 в 23:10

357

личный блог Max Sergeevich →
Про Порно Помню видео где Эрик своим геликом давит порнуху,так что я скажу,что порно это зло,что то дьявольское,это какоето искушение которое мы смотрим,ведь признайтесь смотрели вы порнуху и не раз,например контакт забит поревом по самое небалуй,а ведь малышня смотрит и рукоблудствует,а это как мы знаем грех

30 Май 2009 в 23:23

935

личный блог Captain →
Открытка!

Был на открытие! прикольно все вышло!

30 Май 2009 в 23:41

356

личный блог Max Sergeevich →
Хотят Как Лохов Развести С недавних пор как мы все знаем,машины из америки с охуеными пошлинами так как кризис и Путин хочет типа спасти наш автопром,ну его спасать не надо так как он уже давно мертв,я только хочу написать то что Путин очень глупо поступил,потомучто никто наше гавно брать не будет!!,а возьмут китайское чудо

30 Май 2009 в 23:42

423

личный блог Max Sergeevich →
Про Смотру. ру

Да сайт великолепен,а писать блоги интересно до жути,Эрик И Очкарик спасибо вам!!

30 Май 2009 в 23:58

374

личный блог Костян →
smotra.ru Хорош. Есть баги, которые вылазят, на которые забили, тупиковые сценарии, не правильное расставление акцентов. Но, в цeлом, хорош. Очень в ногу со временем и последним веяниям сети.

Но драйв2 вы не переплюнете с этим функционалом.

31 Май 2009 в 00:05

504

личный блог Егор →
Посмотрим что полусится!… Отличное начало. Интересный проект, со временем буду обживаться здесь по ПОЛНОЙ!!! Если всё получится как обещали — то это будет БОМБА! поживем — увидим. ..
Конечно тяжело представить что сейчас творится в Москве на смотре.)))) Надеюсь будет видео отчет (и не один) и конечно же будут отчеты, коментраи

31 Май 2009 в 00:20

352

личный блог ПУЗО →
крутой сайт)

Хм пистатый сайтец, ТОлько что приехал с открытия)
там много сисек и семак)), спасибо еноту что на поршаке довез))
ну вот))

31 Май 2009 в 00:24

398

личный блог smile25 →
Smotra. ru лучший сайт!?

Ну первое впечатление положительное. думаю это будет лучший автомобильный сайт в России! :)

31 Май 2009 в 00:40

452

личный блог СерГУНДей →
А надо ли?! А надо ли ПРОСИТЬ купить машину у родителей?!!—break—

В последнее время все думаю, может попросить шоб работу дали, там заработать деньги на машину, а не просто «Подарите мне деньги»?! Ну хоть маленькую помощь. .. А то как то смотришь на товарища, которому 20 лет а у него под жопой машина за $$$$$$.

31 Май 2009 в 00:58

723

личный блог Uskov →
Off Road Moving

С Вами ребята все понятно! Скорость, асфальт и все в этом направлении! Это хорошо!
Но давайте не забывать где мы живем и какие у нас дороги. Там где заканчиваются дороги начинается Россия!
Как насчет движения оффроуд? Что скажете? Нужно ли это на этом сайте?

31 Май 2009 в 00:58

435

Ford F-750 превратили в безумный кемпер EarthRoamer XV-HD

EarthRoamer – Dacono, CO 
EarthRoamer, the world leader in off-road, off-grid, luxury expedition vehicles, is excited to announce the expansion of their product line with the highly anticipated XV-HD. Built on a ruggedly capable 4WD Ford F-750 chassis and designed to accommodate up to 6 people in total comfort, the EarthRoamer XV-HD is the answer for those looking to explore the backcountry without sacrificing space or amenities.

Since 1998, EarthRoamer has been designing, building and perfecting expedition vehicles that break all the rules of the traditional RV lifestyle. Coined “XVs,” EarthRoamer’s burly self-sufficient vehicles get you off the grid and away from crowded RV parks so you can travel on your own terms-without the need for propane or a noisy generator. The popular F-550 based XV-LTS model has been a huge success with almost 200 on the road and an impressive track record for performance and craftsmanship. Now, with the larger and more technologically advanced XV-HD, EarthRoamer is taking their proven luxury overlanding concept to new heights.

“The HD is our most innovative product yet,” says Tyler Tatro, President and COO of EarthRoamer. “It utilizes state-of-the-art construction and systems to bring comfort and functionality to the next level.

The capability of the XV-HD starts at its foundation. Utilizing a 4WD converted Ford F-750 with a 6.7L Powerstroke engine, the base for the XV-HD is rock solid. EarthRoamer increases the off-road capability further by adding 46” Michelin XZL’s, rear air suspension with Fox shocks, hydraulic leveling, hydraulic front 30,000 lb. Warn Industries winch, a full LED light array from Baja Designs, and much more. Escaping the crowds and traveling on your own terms is one thing, but staying out in total comfort is the ultimate goal for the XV-HD. With 2,100 watts of solar capability, a 20,000-watt Lithium Ion battery bank, a PTO driven hydraulic generator, 250 gallons of fresh water capacity, and 115 gallons of diesel fuel capacity, the XV-HD is equipped for the long haul.

The rugged brawn of the XV-HD is matched only by it’s luxuriously outfitted interior and handcrafted finishes. Featuring a full bathroom with separate shower, washer/dryer, full kitchen with premium appliances, in-floor radiant heating, Bose Surround Sound entertainment, and King Ranch trim in the cab, the XV-HD lets you have it all – wherever you travel.

For more information, visit www.earthroamer.com/XV-HD.

EarthRoamer designs and builds the world’s bestselling expedition vehicles. Hand built by craftsman in Colorado at the foot of the Rocky Mountains, EarthRoamer XVs enable adventurers to travel far off the beaten path in unparalleled safety and comfort-without the need for water, sewer or electrical hook ups. Designed from the ground-up to be capable of traveling over all types of terrain while providing a luxurious camping experience, an EarthRoamer empowers you to truly Live Your Dream.

HORIZON

Международный академический журнал «Horizon. Феноменологические исследования» издается при Институте философии Санкт-Петербургского государственного университета и при участии Центрального европейского института философии при Карловом Университете и Институте философии Чешской Академии Наук в формате научного рецензируемого периодического издания с 2012 года. Журнал выходит два раза в год, все материалы проходят процедуру рецензирования и экспертного отбора.

Издание рассчитано как на специалистов в области феноменологии и философской герменевтики, так и на широкий круг читателей, имеющих интерес к актуальной философской ситуации.

Целью журнала является формирование и поддержание общего коммуникативного пространства для исследователей, работающих сегодня в области феноменологии и близких к ней философских направлений.

Структура журнала «Horizon. Феноменологические исследования»:

Первый раздел — «Исследования» — содержит в себе оригинальные авторские статьи. Журнал публикует только оригинальные исследования и статьи. В данном разделе материалы публикуются не только на русском, но также и на английском, немецком и французском языках без перевода. Редколлегия просит авторов, предоставляющих свои материалы на английском, немецком или французском языках присылать их уже в прошедшем корректировку у носителя соответствующего языка виде.

Второй раздел — «Переводы и комментарии» — представляет вниманию читателя переводы фрагментов текстов классиков или наиболее видных современных представителей феноменологического направления, а также философских направлений, близких к нему. Тексты переводов, как правило, сопровождаются экзегетическими комментариями. Цель данного раздела — обсудить главным образом малознакомые широкому читателю архивные документы, а также исследования, очерки, эссе авторов, вошедших в галерею мировой науки и философии. Публикация всех переводов в журнале «Horizon. Феноменологические исследования» согласована с правообладателями.

Третий раздел — «Дискуссии» — составлен из отчетов об уже прошедших научных мероприятиях, связанных с феноменологией, как в России, так и за рубежом, отзывов, полемических реплик, интервью и бесед. Редакционная коллегия журнала стремится к тому, чтобы подобные отчеты были не только информационными, но и аналитическими, и ставит перед собой цель тем самым интенсифицировать коммуникацию представителей феноменологического направления современной философии, создавать поле для актуальных дискуссий.

Четвертый раздел — «Рецензии» — составляется из отзывов на публикации по феноменологической тематике, увидевшие свет в течение последних пятнадцати лет. Раздел рецензий призван послужить представлению достойных научного читательского интереса книг, следуя общей цели журнала: совместными усилиями создавать единое мыслительное поле, поле живого общения и обмена новыми идеями.

Пятый раздел — «События» — включает в себя анонсы предстоящих событий, к которым относятся не только проведение научных мероприятий, семинаров, конференций, презентаций, но и выход в свет монографий, научных переводов, защита диссертаций и т.п., ссылки на интересные интернет-источники, справочную литературу.

 

При подготовке специальных выпусков журнала редколлегия имеет право менять структуру журнала (в том числе сокращать количество разделов), а также приглашать со-редакторов для подготовки тематических выпусков.

Редколлегия журнала «Horizon. Феноменологические исследования» приглашает заинтересованных авторов присылать свои материалы для рассмотрения их на предмет возможной публикации в издании. К сотрудничеству приглашаются как российские, так и зарубежные исследователи.

Все материалы следует присылать на имя главного редактора журнала Артёменко Натальи Андреевны по адресу электронной почты: Этот адрес электронной почты защищен от спам-ботов. У вас должен быть включен JavaScript для просмотра.

Подробнее о целях и задачах журнала можно узнать из манифеста издания.

С правилами оформления материалов, предназначенных для публикации в журнале, можно ознакомиться в разделе «Для авторов». Обращаем внимание авторов, что редколлегия вправе отклонить рассмотрение рукописи к публикации, если она не оформлена согласно требованиям журнала. Допускается также ориентироваться авторам при оформлении своих работ на последний номер журнала.

С основными положениями редакционной политики можно ознакомиться в разделе «Редакционная этика».

Журнал рассылается в ведущие университетские и исследовательские центры России и Европы.

Частица: Перевод с русского на французский, значение, синонимы, антонимы, примеры предложений | Русско-французский онлайн-переводчик

Включая использование только ускорителя гравискаларных частиц.

Y compris l’utilisation exclusive de l’accélérateur graviscalaire de particules.

Но все элементы состоят из одних и тех же элементарных частиц.

Mais tous les éléments sont constitués des mêmes particules élémentaires.

Трубопроводы внутри ближайшей сенсорной сетки содержат неограниченный запас этих частиц.

Les conduits à l’intérieur de la grille de capteurs à proximité contiennent un approvisionnement illimité de ces particules.

Заставка с фонтаном частиц.

Écran de veille de fontaine de particules.

Я обнаружил следы радиации в его белых клетках, и его количество экзотических частиц зашкаливает.

J’ai trouvé des traces de radiations dans ses globules blancs, et son nombre de particules exotiques est hors du commun.

Я также физик элементарных частиц. — «Да неужели?» — «Нет, это была шутка. Я тоже комик».

Je suis également physicien des particules. — «Oh vraiment?» — «Non, c’était une blague. Je suis aussi comédien.»

Любые нейтрино, движущиеся быстрее света, будут излучать энергию, оставляя за собой след более медленных частиц, аналогичный звуковому удару сверхзвукового истребителя.

Tout neutrinos voyageant plus vite que la lumière irradierait l’énergie, laissant un sillage de particules plus lentes, analogue au boom sonore d’un avion de chasse supersonique.

Температура измеряет скорость движения частиц, в то время как тепло измеряет общее количество энергии, которую они передают.

La température mesure la vitesse à laquelle les particules se déplacent, tandis que la chaleur mesure la quantité totale d’énergie qu’elles transfèrent.

Свет ведет себя либо как волна, либо как пучок частиц.

La lumière se comporte soit comme une onde, soit comme un faisceau de particules.

Солнце создает гелиосферу, посылая в космос постоянный поток частиц и магнитное поле со скоростью более 670 000 миль в час. Этот поток называется солнечным ветром.

Le soleil crée l’héliosphère en envoyant un flux constant de particules et un champ magnétique dans l’espace à plus de 670 000 miles par heure. Ce flux est appelé le vent solaire.

Не допускайте попадания жидкости или мелких частиц в консоль.

Ne laissez pas de liquide ou de petites particules pénétrer dans la console.

Космические скафандры защищают космонавтов от травм от попадания мелких частиц космической пыли.

Les combinaisons spatiales protègent les astronautes contre les blessures causées par les impacts de petits morceaux de poussière spatiale.

Как мы можем определить равновесие для системы движущихся частиц?

Comment définir l’équilibre d’un système de particules en mouvement?

Большинство иностранцев никогда не смогут полностью освоить использование немецких модальных частиц.

La plupart des étrangers ne maîtriseront jamais pleinement l’utilisation des particules modales allemandes.

Современное понимание динамики квантовых частиц приняло неинтуитивный оборот с введением концепции корпускулярно-волнового дуализма.

La compréhension moderne de la dynamique des particules quantiques a pris une tournure non intuitive avec l’introduction du concept de dualité particule-onde.

Поскольку космос в основном пуст, существует очень мало частиц, которые могут передавать энергию космическому аппарату.

Étant donné que l’espace est principalement vide, il y a très peu de particules qui peuvent transférer de l’énergie au vaisseau spatial.

Следует избегать висящих частиц любой ценой на английском языке.

Les particules pendantes doivent être évitées à tout prix en anglais.

Скорость сухого осаждения твердых частиц параметризуется с использованием скорости трения и высоты шероховатости.

La vitesse de dépôt à sec des composés particulaires est paramétrée à l’aide de la vitesse de frottement et de la hauteur de rugosité.

Параметризация скоростей сухого осаждения в зависимости от размера частиц и шероховатости поверхности нуждается в переоценке в свете новых данных измерений.

Les paramétrages des vitesses de dépôt à sec en fonction de la taille des particules et de la rugosité de surface doivent être réévalués à la lumière de nouvelles données de mesure.

Кто — то предположил, что эти новые высокие энергии в сочетании со специфическим способом разрушения частиц уничтожат нас.

On a émis l’hypothèse que ces nouvelles énergies élevées, combinées avec la manière spécifique dont les particules seraient brisées, nous anéantiraient.

Это была дата испытания ускорителя частиц.

C’était la date du test d’accélérateur de particules.

Эрнест Резерфорд изобрел искусство столкновения частиц.

Ernest Rutherford pour inventer l’art de la collision de particules.

Я смотрел сквозь костяную пыль и нашел несколько частиц, которые имеют достаточную массу, чтобы исследовать.

Je regardais à travers la poussière d’os et j’ai trouvé quelques particules qui ont suffisamment de masse pour être examinées.

Беспорядок частиц, который мы видим, — не что иное, как мешанина нот, колеблющихся на струне.

Le fouillis de particules que nous voyons n’est rien d’autre que le fouillis de notes, vibrant sur une corde.

В конце концов, считается, что этот ветер попадает в межзвездную среду – совершенно другой поток частиц, выбрасываемых из смертоносных взрывов массивных звезд.

On pense finalement que ce vent frappe le milieu interstellaire — un flux complètement différent de particules expulsées des explosions mortelles d’étoiles massives.

При компьютерном моделировании конфигураций дискообразных частиц, движущихся в определенных условиях, эта сила создает результаты, которые пугающе наводят на мысль об интеллекте.

Dans les simulations informatiques de configurations de particules en forme de disque se déplaçant dans des contextes particuliers, cette force crée des résultats qui évoquent étrangement l’intelligence.

Гидравлические испытания могут быть заменены комбинацией магнитных частиц и ультразвуковых методов исследования.

L’essai hydraulique pourrait être remplacé par une combinaison de méthodes d’examen par particules magnétiques et par ultrasons.

Сколько ученых в мире … используют ускоритель элементарных частиц в своем проекте?

Combien de scientifiques dans le monde … utilisent un accélérateur de particules dans un projet?

Тамарианцы направляют пучок частиц в верхние слои атмосферы.

Les Tamarian projettent un faisceau de soutien de particules dans la haute atmosphère.

Я думаю, она была физиком элементарных частиц.

Je pense qu’elle était physicienne des particules.

Требуются вовремя», чтобы увидеть, как они включают ускоритель частиц.

Voulait rentrer à la maison à temps pour les voir allumer l’accélérateur de particules.

Эта закрученная масса, или «туманность», начала остывать, а затем конденсироваться и разделяться на кольца частиц.

Cette masse tourbillonnante ou «nébuleuse» a commencé à refroidir et, comme elle l’a fait, s’est condensée et s’est séparée en anneaux de particules.

Кто-нибудь из вас, кроме Кассандры, знает физику элементарных частиц?

Est-ce que l’un de vous, à part Cassandra, connaît la physique des particules?

«Перекристаллизация частиц известняка и проникновение посторонних элементов из окружающей почвы.

«La recristallisation des particules de calcaire et l’infiltration d’éléments étrangers du sol environnant.

Солнечное цунами послало огромную волну гамма-частиц.

Le tsunami solaire a envoyé une énorme vague de particules gamma.

Чиновники сейчас пытаются отключить ускоритель частиц, но до сих пор не смогли восстановить контроль над системой.

Les responsables tentent maintenant d’arrêter l’accélérateur de particules, mais n’ont jusqu’à présent pas réussi à reprendre le contrôle du système.

Применение методов сокращения выбросов оксидов азота, диоксида серы и твердых частиц из дымовых газов также может привести к удалению тяжелых металлов.

L’application de techniques pour réduire les émissions d’oxydes d’azote, de dioxyde de soufre et de particules provenant des gaz de combustion peut également éliminer les métaux lourds.

Достаточно простой, понятный и интересный урок по созданию эффекта рассеивания частиц.

Tutoriel assez simple, clair et intéressant pour créer un effet de dispersion de particules.

Формирование удара и ускорение частиц — универсальные процессы.

La formation de chocs et l’accélération des particules sont des processus universels.

Под морским дном работали Джордж и Карсон. с пучком частиц, чтобы расширить их туннель.

Sous le fond marin, George et Carson ont travaillé avec un faisceau de particules pour prolonger leur tunnel.

Я уже настроил излучатели трактора для создания луча частиц и определил точку на поверхности.

J’ai déjà configuré les émetteurs du tracteur pour créer le faisceau de particules et j’ai localisé le point cible sur la surface.

Тамарианский корабль создал поле рассеяния частиц в ионосфере планеты.

Le vaisseau Tamarian a créé un champ de diffusion de particules sur l’ionosphère de la planète.

Ми-Ма и поп-поп пели рождественские гимны, а я сидел перед камином и пытался построить из Лего ускоритель частиц высокой энергии.

Mee-Maw et Pop-Pop, chantant des chants de Noël pendant que je devant le feu et a essayé de construire un accélérateur de particules à haute énergie à partir de Legos.

И мы продолжаем делать это и строим более мощные машины, ускорители частиц.

Et nous continuons à faire cela et construisons des machines plus puissantes, des accélérateurs pour les particules.

Серебряная кольцевая рыба проплыла мимо них, волнообразно изгибаясь и мгновенно смыкаясь, как радужная оболочка, вокруг пищевых частиц, чтобы ассимилировать их.

Un poisson en anneau d’argent flottait à côté d’eux, ondulant, et se refermant comme un iris, instantanément, autour des aliments partides, pour les assimiler.

Он ускорил два пучка ультратонких частиц в противоположных направлениях вокруг ускорительной трубки.

Il a accéléré deux faisceaux de particules ultrafines dans des directions opposées autour du tube accélérateur.

Но Хокинг спросил, что произойдет, если эта пара частиц столкнется с черной дырой?

Mais Hawking a demandé, que se passerait-il si cette paire de particules se heurtait à un trou noir?

В противном случае каждый раз, когда вы смываете, в воздух распыляется мелкий туман аэрозольной мочи и фекальных частиц.

Sinon, une fine brume d’urine aérosol et de particules fécales est projetée dans l’air à chaque rinçage.

Плазменные ракеты-это современная технология, которая превращает топливо в горячий суп из электрически заряженных частиц, известных как плазма, и выбрасывает его, чтобы толкать космический корабль.

Les fusées à plasma sont une technologie moderne qui transforme le carburant en une soupe chaude de particules chargées électriquement, connue sous le nom de plasma, et l’éjecte pour pousser un vaisseau spatial.

Если только метеориты не содержали мутационный элемент, как ускоритель частиц, который вызвал ваши силы.

À moins que les météorites ne contiennent un élément mutatif, comme l’accélérateur de particules qui a causé vos pouvoirs.

На крупнейшем в мире ускорителе элементарных частиц в ЦЕРНе, в Женеве, Швейцария.

Au plus grand accélérateur de particules du monde au CERN, à Genève, en Suisse.

Верно то, что мы лишь временные хранители частиц, из которых мы сделаны.

Ce qui est vrai, c’est que nous ne sommes que les gardiens temporaires des particules dont nous sommes faits.

Это слоистое поле частиц.

C’est un champ de particules en couches.

Липазы используются в процессе обезжиривания для гидролиза жировых частиц, внедренных в кожу.

Les lipases sont utilisées dans l’opération de dégraissage pour hydrolyser les particules de graisse incrustées dans la peau.

В настоящее время компания NIOSH разработала девять классификаций утвержденных респираторов для фильтрации твердых частиц, основанных на сочетании серии респираторов и уровня эффективности.

Le NIOSH a actuellement établi neuf classifications de respirateurs filtrants à particules approuvés basés sur une combinaison de la série de respirateurs et du niveau d’efficacité.

С статистической и вероятностной точек зрения фильтры частиц могут быть интерпретированы как интерпретации частиц среднего поля вероятностных мер Фейнмана-Каца.

Du point de vue statistique et probabiliste, les filtres à particules peuvent être interprétés comme des interprétations de particules de champ moyen des mesures de probabilité de Feynman-Kac.

Структура почвы — это расположение частиц и связанных с ними пор в почвах в диапазоне размеров от нанометров до сантиметров.

La structure du sol est la disposition des particules et des pores associés dans les sols sur une plage de taille allant du nanomètre au centimètre.

Протоны также имеют внеполярное происхождение от галактических космических лучей, где они составляют около 90% от общего потока частиц.

Les protons ont également une origine extrasolaire des rayons cosmiques galactiques, où ils représentent environ 90% du flux total de particules.

Электрофорез-это термин, используемый для миграции взвешенных в Газе заряженных частиц в электростатическом поле постоянного тока.

L’électrophorèse est le terme utilisé pour la migration de particules chargées en suspension dans un gaz dans un champ électrostatique à courant continu.

Основная цель диспергирования пигментов-разрушение агрегатов и образование стабильных дисперсий частиц пигмента оптимального размера.

Le but principal de la dispersion de pigment est de décomposer les agrégats et de former des dispersions stables de particules de pigment de taille optimale.

Текстура почвы определяется относительными пропорциями отдельных частиц песка, ила и глины, которые составляют почву.

La texture du sol est déterminée par les proportions relatives des particules individuelles de sable, de limon et d’argile qui composent le sol.

При отборе проб гетерогенных смесей частиц дисперсия ошибки отбора проб обычно не равна нулю.

Lors de l’échantillonnage de mélanges hétérogènes de particules, la variance de l’erreur d’échantillonnage est généralement non nulle.

В январе 2017 года Kaye сообщила, что редкоземельные минералы, такие как сульфид церия и стронция, также были идентифицированы среди частиц из tie.

En janvier 2017, Kaye a signalé que des minéraux de terres rares tels que le sulfure de cérium et de strontium avaient également été identifiés parmi les particules du lien.

Это позволяет определять площадь поверхности S частиц с помощью SAS.

Cela permet de déterminer la surface S des particules avec SAS.

Химические потенциалы бозонов и фермионов связаны с числом частиц и температурой статистикой Бозе-Эйнштейна и статистикой Ферми-Дирака соответственно.

Les potentiels chimiques des bosons et des fermions sont liés au nombre de particules et à la température respectivement par les statistiques de Bose – Einstein et de Fermi – Dirac.

Безлопаточный ионный ветрогенератор или силовое ограждение — это устройство, которое генерирует электрическую энергию, используя ветер для перемещения заряженных частиц в электрическом поле.

Un générateur de vent ionique sans vannes ou une clôture électrique est un appareil qui génère de l’énergie électrique en utilisant le vent pour déplacer des particules chargées à travers un champ électrique.

Большая часть сложного характера выдержанного марочного портвейна происходит от продолжающегося медленного разложения твердых частиц винограда в каждой бутылке.

Une grande partie du caractère complexe du vieux Porto millésimé provient de la lente décomposition continue des solides de raisin dans chaque bouteille.

Стандартная модель физики элементарных частиц описывает электромагнитное взаимодействие и слабое взаимодействие как два разных аспекта одного электрослабого взаимодействия.

Le modèle standard de la physique des particules décrit l’interaction électromagnétique et le interaction faible en tant que deux aspects différents d’une seule interaction électrofaible.

Центральной частью нейтронного генератора является сам ускоритель частиц, иногда называемый нейтронной трубкой.

La partie centrale d’un générateur de neutrons est l’accélérateur de particules lui-même, parfois appelé tube à neutrons.

Некоторые из основных управляющих уравнений для грохота ударного типа включают скорость грохочения, эффективность грохочения и время пребывания частиц на грохоте.

Certaines des principales équations régissant un tamis trommel comprennent le taux de tamisage, l’efficacité du tamisage et le temps de séjour des particules dans le tamis.

Первое использование коронного разряда для удаления частиц из аэрозоля было сделано Хольфельдом в 1824 году.

La première utilisation de la décharge corona pour éliminer les particules d’un aérosol a été faite par Hohlfeld en 1824.

Обзор 2018 года показал, что отрицательные ионы воздуха очень эффективны в удалении твердых частиц из воздуха.

Un examen de 2018 a révélé que les ions atmosphériques négatifs sont très efficaces pour éliminer les particules de l’air.

Атмосфера не пострадала в заметном масштабе, поскольку подавляющее большинство твердых частиц осело либо в водной системе, либо в почве, окружающей растение.

L’atmosphère n’a pas été affectée à une échelle notable, car l’écrasante majorité des particules se sont déposées soit dans le système hydrique, soit dans le sol entourant la plante.

Учитывая эквивалентность массы и энергии, выраженную формулой Альберта Эйнштейна E = mc2, любую точку в пространстве, содержащую энергию, можно рассматривать как имеющую массу для создания частиц.

Compte tenu de l’équivalence de la masse et de l’énergie exprimée par E = mc2 d’Albert Einstein, tout point de l’espace qui contient de l’énergie peut être considéré comme ayant une masse pour créer des particules.

Это говорит о том, что сама материя не может быть подразделена бесконечно много раз, и должен существовать конечный уровень элементарных частиц.

Cela suggère que la matière elle-même ne peut pas être subdivisée indéfiniment de nombreuses fois et qu’il doit y avoir un niveau ultime de particules fondamentales.

Парамагнитные редкоземельные ионы используются в качестве датчиков частиц путем измерения спиновых флипов парамагнитных атомов, вызванных теплотой, поглощенной в материале с низкой теплоемкостью.

Les ions de terres rares paramagnétiques sont utilisés comme capteurs de particules en détectant les retournements de spin des atomes paramagnétiques induits par la chaleur absorbée dans un matériau à faible capacité thermique.

Большинство высокоэнергетических частиц, помимо вытеснения атома углерода из узла решетки, также передают ему достаточно избыточной энергии для быстрой миграции через решетку.

La plupart des particules à haute énergie, outre le déplacement de l’atome de carbone du site du réseau, lui transmettent également suffisamment d’énergie excédentaire pour une migration rapide à travers le réseau.

Заболевание возникает в результате переключения вирусных частиц в одном сенсорном ганглии с их латентных лизогенных циклов на их активные литические циклы.

La maladie résulte du passage de particules virales dans un seul ganglion sensoriel de leurs cycles lysogéniques latents à leurs cycles lytiques actifs.

Он определяется как масса многих частиц материала, деленная на общий объем, который они занимают.

Il est défini comme la masse de nombreuses particules du matériau divisée par le volume total qu’elles occupent.

Самые красивые современные машины — Международный Водительский Центр

Есть автомобили, которые настолько ласкают глаз, что взгляда не оторвать. Как на породистую лошадь, на них идут хотя бы только посмотреть. Самые смелые делают селфи на фоне таких автомобилей. При этом ценителей прекрасного рукотворного много не только среди сильной половины человечества.

Конечно, на вкус и цвет… Но всё же попробуем охарактеризовать наиболее привлекательные авто современности и описать их особенности. При этом красивых раритетов касаться не будем.

Aston Martin CC 100 – чудо современного автомобилестроения

Среди уникальных технических творений, которыми, благодаря полёту фантазии автомобильных дизайнеров, восхищаются автомобилисты всего мира, надо назвать Aston Martin CC 100. Его по праву именуют настоящим произведением искусства. Автомобиль имеет классическую двухместную конфигурацию Speedster, и представляет собой гармоничное сочетание традиционного стиля и новейших технологий. У него шестилитровый двигатель, мощность 517 лошадок, а максимальная скорость 290 км/ч. Связка «атмосферника» V12, совмещённого с шестиступенчатым «роботом», позволяет CC100 набирать сотню с места за четыре секунды с небольшим. Переключение скоростей осуществляется посредством подрулевых лепестков.

Этого спидстера рекламируют как топовую автомодель с футуристическим внешним дизайном. Данный автомобиль был создан в рамках празднования столетнего юбилея бренда Астон Мартин. От носа до хвоста CC100 насчитывает почти четыре с половиной метра. Ширина превышает два метра (включая зеркала).

В интерьере можно найти комбинацию приборов в виде дисплея и металлические переключатели, словно взятые с приборных досок спорткаров пятидесятых. В отделке кузова и салона используется большое количество карбоновых декоративных элементов. Кузов автомобиля изготовлен специалистами из углеродного волокна высочайшего качества.

Peugeot Onyx – драгоценный камень

Автомобиль Peugeot Onyx вызывает у автолюбителей шок. Французские дизайнеры не поскупились проконсультироваться у ювелиров, и сейчас данная модель вызывает неподдельное восхищение окружающих. У машины Peugeot Onyx панели кузова сделаны из карбона, в них встроены боковые медные вставки, и всё перечисленное дополняет отделка из алюминия. У дизельного турбированного двигателя 600 лошадиных сил. Внутри французский красавец отделан валяной шерстью. Onyx разгоняется до 160 км/ч и выше. Это позволяет дизельный V8 от 908 Le Mans 2011 г. объёмом 3,7 л. Конструкцию монокока значительно облегчил карбон (12 деталей весят всего 100 кг), а уравновесил необычный и тяжёлый материал кузовных элементов – медь. Медь ничем не покрывали, и теоретически Onyx должен «состариться», когда медь окислится и покроется зеленой патиной. Есть в Peugeot Onyx и другие немыслимые материалы. Приборная панель сделана из прессованной макулатуры – причём текстура у неё, говорят, как у дерева. Лобовое стекло – не стеклянное, а из хайтекового полиметилметакрилата.

Peugeot Onyx не слишком реалистичен, но очень крут. Это правильный, убедительный концепт: классно выглядит и прекрасно едет. Именно это и нужно Peugeot – реалистичность и перспектива.

McLaren P1 – уникальный гиперкар

McLaren P1 – британский гиперкар с аэродинамическим внешним дизайном весом около 1,4 тонны. Гибридный мотор (уникальная силовая установка из электромотора и бензинового двигателя) объёмом 3,8 литров разгоняет автомобиль менее чем за 7 секунд до скорости 200 км/ч. Двигатель восьмицилиндровый битурбированный. Но поражает воображение не только мощность двигателя и дизайн авто, но и его просто фантастическая стоимость – около 1 миллиона евро. Таких автомобилей мир увидит только 375.

Высокую жёсткость и прочность конструкции гиперкара придают композитные материалы. Масса шасси из карбона составляет 100 кг, общая масса авто при этом достигает 1400 кг (четверть которых приходятся на трансмиссию и двигатель). Кузов типа монокок имеет в основе пространственную конструкцию из углепластика. Компоновка задняя среднемоторная. Обвес аэродинамический, включает передний бампер с изящной губой, боковые юбки и задний бампер с развитым диффузором сложной формы, а также активное антикрыло. Последнее регулируется бортовым компьютером, автоматически изменяя угол атаки и высоты. Поэтому при необходимости легко изменяется коэффициент лобового сопротивления – на 25% – и прижимная сила таким образом существенно увеличивается или уменьшается.

В салоне нет ничего лишнего – никаких декоративных накладок, шильдиков, шумоизоляции, то есть интерьер минималистичен. Всё в салоне изготовлено из карбона. Исключение составляют гоночные кресла. Они обиты алькантарой на титановом каркасе. На приборной панели никаких традиционных циферблатов – только три плазменных дисплея, куда выводится вся необходимая информация.

Никаких регулировок кресел (водительского и пассажирского) нет: все параметры устанавливаются при покупке на автозаводе в индивидуальном порядке, поэтому McLaren P1 – автомобиль одного владельца.

Lamborghini Aventador Roadster – земной инопланетянин

Lamborghini Aventador Roadster разработан на основе космических технологий и исполнен из углепластика. Его разгон до 100 км/ч занимает всего 3 секунды, а максимальная скорость позволяет достичь 350 км/ч. При этом лошадок у него аж 700 при 6,5-литровом движке (V12 – настоящее чудо). Коробка передач роботизированная семиступенчатая ISR, привод полный 4WD с муфтой Haldex 4-го поколения. В наличии независимая подвеска с двухрычажной архитектурой спереди и сзади, адаптивные амортизаторы Magneto Rheological Suspension, усилитель рулевого управления Lamborghini Dynamic Steering и углеродокерамические тормоза.

Снаряженная масса кузова открытой версии итальянского суперкара (крыша, к слову, состоит из двух углеволоконных половинок (карбоновых) массой менее 6 кг, убираемых в багажник буквально за 30 сек) составляет 1575 кг. Roadster даже без крыши поражает своей цивилизованностью. На скорости 130 км/ч спокойно можно разговаривать. Aventador головокружительно крут: это современный шедевр дизайна, и собран он отлично. Его мощность, скорость и красота дают шанс посягнуть на трон королевства мегаденег.

Это итальянское авто славится породистой красотой. Все машины уходят с завода по предварительным заказам. С крышей или без, родстер даже красивее купе! Это безумно сложное произведение промышленного дизайна. Салон, как всегда, изумителен – все эти авиапримочки, кнопка стартера под откидной крышечкой, приборы, «нарисованные» на TFT-дисплее, широкие полотнища кожи – всё собрано исключительно качественно, и сидеть, удивительное дело, удобно.

Aston Martin Rapide – модель люкс-класса

Aston Martin Rapide красуется на первых полосах известных мировых издания для автолюбителей. Этот 4-дверный спортивный седан производства британской компании оснащён 6-литровым двигателем V12, мощностью 477 лошадиных сил. В конструкции Aston Martin Rapide используются материалы, которые производятся для космической промышленности. Их отличительной особенностью является то, что за основу берётся склеивание деталей, а не сварка. Благодаря этому вес мощнейшего автомобиля удалось снизить до 1950 кг. В активе Астон Мартин Рапид S – карбоновый карданный вал и дифференциал повышенного трения.

Обновленная версия Rapide S вышла с новой мощностью, увеличенной до 558 лошадиных сил. Предельная скорость автомобиля – 305 км/ч с разгоном за 4,9 с до 100 км/ч. При всё этом у Aston Martin Rapide довольно демократичная цена – 197 тысяч долларов. Клиентам доступен сервис индивидуализации «Q by Aston Martin», позволяющий выбрать практически любые варианты материалов и расцветки для оформления интерьера.

Это идеальная машина для путешествий вдвоём на дальние дистанции. В этом её суть. Для пассажиров сзади предусмотрено всё: раздельный климат, вентиляция сидений (настоящие спортивные кресла!), мониторы. В оформлении салона роскошного седана появилось дерево, покрытое черным рояльным лаком, а кресла обиты перфорированной кожей. Раздельные задние кресла теперь откидываются одним нажатием кнопки, увеличивая объём багажника в три раза.

В 2018 г. автомобиль будет снят с производства. Вместо него на рынке появятся новые модели DBX, Lagonda, а также электрокар.

SSC Tuataro – пришелец из автокосмоса

SSC Tuataro – суперкар американской компании Shelby Super Cars –  отличается необычным внешним видом, но оригинальная внешность – не главное его достоинство. Технические характеристики тоже впечатляют – 2,5 с до 100 км/ч при разгоне и максимальной скорости 400 км/ч. Эта американская красавица сочетает в себе два классическиx цвета, чёрный цвет дороги и строгости, и белый цвет невинности. Рождён этот автошедевр в 2011 г. и сразу стал любимцем сторонников скорости и роскоши.

Имя Tuatara было дано авто в честь необычной новозеландской рептилии, основной особенностью которой является невероятно быстрое изменение ДНК. Автомобиль оборудован сверхлёгкими карбоновыми дисками (по 5,8 кг каждый) и уникальными углерод-керамическими тормозами. Облегчённый V-образный 8-цилиндровый двигатель SSC Tuatara, дополненный двумя турбинами, выдаёт максимальную мощность 1350 л.с. при 6800 об/мин и при этом весит всего 194 килограмма. Будущим владельцам предоставляется выбор между 7-ступенчатой «механикой» H-Pattern и 7-ступенчатым секвентальным «роботом» SMG с тройным диском сцепления. Кроме того, суперкар оснащён системами контроля тяги и ABS.

Bugatti Veyron Super Sport – железная леди

Bugatti Veyron Super Sport родилась в 2010-м г. Это гиперкар называют самым быстрым серийным авто. Это самая известная спортивная машина, которую знает скорее всего каждый. Сегодня он ласкает взгляд оранжевыми панелями на чёрном корпусе, и этот контраст яркости и элегантности отмечен специалистами как дизайнерская находка. Дизайн очень серьёзно продуман в плане аэродинамики. Авто получил плавленые рельефные формы, узкие галогенные фары, а также два больших воздухозаборника, которые охлаждают передние тормоза. Спереди находится высокая решётка c хромированной окантовкой. Сбоку можно заметить сильно раздутые колесные арки Вейрона. Также сбоку находится ещё один большой воздухозаборник, который ведёт воздух к моторному отсеку. В верхней части находится круглая крышка бака, которая выполнена из полированного алюминия.

Задняя часть получила четыре круглых привлекательных фонаря, а под ними есть решётки, задача которых – отводить горячий воздух из мотора. Ещё чуть ниже расположен диффузор и огромный квадратный патрубок системы выпуска. Верхняя часть обладает выдвигающимся спойлером, а дальше расположился моторный отсек, который по бокам имеет два воздухозаборника, они, в свою очередь, принимают воздух сверху.

Внутри используются качественные материалы обшивки, это кожа, алькантара и хромированные вставки, но покупатель может выбрать как материалы, так и цвет. Установлены отличные кресла с прекрасной боковой поддержкой, которые отлично удерживают водителя и пассажира в поворотах. Сиденья оснащены электрорегулировкой для того, чтобы каждый смог настроить удобную для себя посадку.

На Bugatti Veyron Super Sport установлен турбированный мотор с четырьмя турбинами, это W16. То есть тут находится 16 цилиндров, которые имеют W-образное распределение.

Данный агрегат при объёме в 8 литров выдаёт 1001 лошадиную силу, но есть версия, которая имеет 1200 лошадиных сил. С помощью данного агрегата Bugatti Veyron Super Sport набирает первую сотню за 2,5 секунды, а максимальная скорость равняется 407 км/ч, а с более мощным агрегатом максимальная скорость поднимается до 415 км/ч.

Мотор Бугатти Вейрон работает в паре с семиступенчатой роботизированной коробкой передач Recardo. То есть авто имеет постоянный полный привод. В автомобиле находится 11 датчиков, который следят за охлаждением мотора.

Агрегат собирается в Германии из 3500 деталей. Мотор употребляет 40 литров 98 бензина в городе, а при спокойной езде на трассе этот показатель упадёт до 14 литров. Кстати, если разогнаться до максимальной скорости, то будет уходить практически один литр на каждый километр.

У машины жёсткая подвеска, но последняя прекрасно справляется с поворотами и в общем показывает просто отличную управляемость. Останавливается авто с помощью больших керамических тормозов.

Bentley Continental GT 2003 – королевская красотка

Bentley Continental GT 2003 строга и грациозна, но это не мешает ей выглядеть как полноценный автомобиль представительского класса. Роскошь снаружи и внутри, дорогие породы дерева и кожа в интерьере салона, акустическая система BOSE и мультимедийный интерфейс Logic by Pioneer, – всё это говорит само за себя. Владеет такой королевой, конечно же, по меньшей мере аристократ.

Данное британское авто получило обновление в виде голосовой активации бортового телефона, увеличенного числа опций оформления с добавлением цвета Магнолия для интерьера. А ещё у него хромированные вытяжные ручки открытия вентиляционно-отопительных дефлекторов в салоне. Кроме ручек дефлекторов, в салоне 29 гравировок, вышивок и тиснений логотипа Bentley (даже на болтах и колпачках ниппелей) и известной всему миру сетки фальш-радиатора типа «рабица».

Максимальная скорость Bentley Continental GT 2003 – 305 км/ч, разгон до 100 км/ч происходит за 4,9 секунд, мощность двигателя 560 лошадей, а объём двигателя почти 6 литров.

Это абсолютный автомобиль. Это такая машина, в которой уже всё включено: привод – постоянно и полно, мотор – с глубоким секундным вздохом на то, чтобы оживить все 12 цилиндров, телевизор – чтобы знать, о чём поёт Марина Диамандис. И пусть его консервативно-лейбористская внешность не есть внешность «дримкара», но он абсолютно быстр, абсолютно легко управляем, сверхустойчив и абсолютно комфортен. Такой абсолютизм достигается расходом в 37 и более литров (по бортовому компьютеру в городском цикле).

Lexus LC 500

Lexus LC 500 – oднa из самыx попyляpных марок премиального сегмента автомобильного рынка. Этот красавец имеет под капотом 5-литровую «восьмёрку», выдающую 477 л.с. Данный силовой агрегат был создан на основе наработок, полученных в ходе 24-часовой гонки на трассе Нюрбургринг и гонки по подъёму на гору Пайкс Пик. Этот двигатель V8 ручной сборки агрегатируется с первой в мире 10-ступенчатой автоматической коробкой передач для легкового автомобиля, предлагая впечатляющий разгон и великолепное звучание.

В зависимости от стиля вождения и дорожных условий регулируемая адаптивная подвеска может сделать движение более комфортным или более жёстким, управляя характеристиками всех четырёх амортизаторов и внушительным диапазоном 650 различных настроек.

Система объёмного звучания мирового класса Mark Levinson® Premium Surround с 13 динамиками на основе технологии GreenEdgeTM специально создавалась с учётом акустических свойств салона LC 500. Непревзойдённое качество и натуральность звучания помогают воссоздать атмосферу домашнего цифрового кинотеатра. При этом технология Clari-FiTM позволяет компенсировать потери звука при цифровой компрессии в формате MP3.

По центру панели приборов разработчики расположили мультиинформационный дисплей, на котором отображается вся ключевая информация о движении, включая предупреждения системы безопасности и команды навигационной системы. Все необходимые данные всегда под рукой у водителя.

Успех данного авто кроется в сотрудничестве инженеров и дизайнеров. Применялись кардинально новые концепции, когда надо было создать низкую линию крыши, характерную для купе, и при этом обеспечить комфортную посадку четырёх человек. Атлетичный профиль купе отличают стремительные линии крыши, слегка сходящиеся в задней части кузова и создающие таким образом уникальный силуэт.

Porsche Carrera GT 2005 – обаятельная немка

Porsche Carrera GT 2005 – железная лошадка с удивительным «экстерьером»: она элегантна и классически строга, но передвигается с быстротой ягуара и скоростью ветра. Porsche Carrera GT оснащалась 5,7-литровым 612-сильным V10 и хорошей старомодной 6-ступенчатой МКП. В общей сложности с конвейера сошли 1 270 машин.

Интересно, что центральные колесные контргайки со стороны водителя красного цвета, а со стороны пассажира – синего. Porsche промаркировал их специально, чтобы не допустить ошибок: один комплект имеет правую резьбу, а другой – левую.

У Carrera GT одно из самых сложных сцеплений среди всех серийных автомобилей, а именно – первое в мире керамическое сцепление PCCC. Porsche снабдил Carrera GT автоматическим дросселем в качестве помощи при трогании. Хотя это противоречит здравому смыслу, водители не должны трогать педаль газа при старте. Нужно плавно отпустить сцепление и жать на педаль акселератора только тогда, когда сцепление полностью отпущено.

Стандартный рычаг КП Carrera GT выполнен из березы и ясеня, чтобы отдать дань уважения рычагу Porsche 917 из пробкового дерева. Древесина легче, чем алюминий, и она не проводит тепло, как большинство металлов. Это было особенно важно для пилотов Porsche 917, которым рычаг из обычных материалов обжигал руки. На второй год производства Carrera GT можно было заказать с опциональным рычагом коробки передач из углеволокна.

Carrera GT – это первый серийный автомобиль, применивший шасси-монокок из армированного углеволокном пластика.

Затраты на техническое обслуживание Carrera GT довольно внушительные. Замена масла стоит примерно 1 200 долларов. Новый генератор – 2 400 долларов. Новые шины, которые рекомендуется менять каждые четыре года, – 2 500 долларов. Лобовое стекло – 9 000 долларов. Новое сцепление стоит более 20 000 долларов. Техосмотр с интервалом 30 000 миль обойдётся в 30 000 долларов. Ну что ж, – быть владельцем Porsche Carrera GT 2005 совсем непросто, зато как престижно!

Если у вас ещё нет международного водительского удостоверения, вы можете легко и быстро оформить его на нашем сайте. С международным водительским удостоверением вы сможете брать красивые автомобили в аренду в любой точке мира!

Bose продает свою революционную электромагнитную подвеску

Этот сайт может получать партнерские комиссии по ссылкам на этой странице. Условия эксплуатации.

Спустя тридцать семь лет после того, как д-ру Амару Бозе пришла в голову идея усовершенствовать электромагнитный драйвер громкоговорителя в качестве адаптивной подвески автомобиля, Bose продает технологию ClearMotion, другой технологической компании из Бостона, основанной выпускниками Массачусетского технологического института.Компания Bose дошла до разработки прототипов автомобилей, которые были выставлены в 2004 году, но выпустила на рынок ответвление сидений с электромагнитной подвеской для водителей дальнобойных грузовиков.

Немодифицированная подвеска и подвеска Bose на ухабистой дороге, 2004 год.

Генезис электромагнитной подвески

Во время внедрения технологий в штаб-квартире Bose в Фрамингеме, штат Массачусетс, в 2004 году Амар Боз сказал: «Это первый раз Система подвески одинакова как для спортивного автомобиля, так и для роскошного автомобиля.Он был привлечен к разработке альтернатив традиционным подвескам с пружинами и амортизаторами после опыта владения Pontiac 1957 года с молодой пневмоподвеской и Citroen 1967 года с постоянно протекающей гидравлической подвеской.

Бозе полагал, что драйвер громкоговорителя, состоящий из магнита и электромагнитной катушки, которая толкает конус динамика внутрь и наружу, может быть серьезно увеличен для перемещения не только бумажного диффузора, но и автомобиля весом 1000 фунтов на каждом углу. Бозе создал математическую модель подвески.Для этого потребовались более совершенные и мощные электромагнитные двигатели, усилители мощности, алгоритмы управления и питание микропроцессоров — все из которых, как он полагал, со временем станет доступным.

Bose основал проект skunkworks в 1980 году и назвал его Project Sound, чтобы скрыть истинную сущность от бухгалтерии Bose. Двадцать четыре года спустя компания почувствовала себя достаточно комфортно с Project Sound, чтобы продемонстрировать его СМИ и аналитикам.

Подвеска Bose в Lexus LS400 1994 года выпуска.

Дневная разница в качестве езды

Линейный мотор на каждом углу заменил традиционные пружины, амортизаторы.

На презентации летом 2004 года компания Bose продемонстрировала модифицированные и немодифицированные Lexus LS400 1994 года и Porsche 911. На них с трудом проходили повороты и неровности, которые ударяли по передней, а затем задней осям, а также еще один набор неровностей, которые поднимали левую. покрышка но не правая передняя, ​​то задняя.

Неровности спереди и сзади были неудобными на короткой дороге на стандартном Lexus и, что удивительно, почти незаметны на подвеске Bose.Project Sound не просто демпфировал неровности проезжей части, но и активно им противодействовал.

Чередующиеся неровности влево-вправо на стандартной подвеске были настолько сильными в Porsche, что водителю-испытателю приходилось носить шлем, чтобы не сотрясать голову при неоднократных ударах в боковое стекло.

Постоянный посетитель Bose знает, что у компании всегда есть что-то важное для посетителей. В данном случае говорилось, что это был тест Lexus, движущегося на большой скорости по железнодорожным путям. Водитель на скорости приблизился к железнодорожной эстакаде, вагон присел на корточки (ход подвески 8 дюймов), затем линейные двигатели перешли в режим полного расширения, вагон оторвался от земли и проплыл по железнодорожной эстакаде с запасом дюймов. .После этого водитель вышел, поклонился толпе, указал на машину, нажал кнопку, и передняя подвеска тоже опустилась, и поклонился, когда фары мигали.

В конце демонстрации представители Bose объяснили, что необходимо для вывода подвески на рынок серийного автомобиля к концу десятилетия: стоимость должна снизиться до разумного уровня для автомобиля высокого класса, и вес должен был снизиться не более чем на 50 фунтов на угол больше, чем у существующей подвески.Это означает, что серийный автомобиль будет весить дополнительно 200 фунтов.

Многие ведущие мировые автопроизводители встречались с Bose, но автомобили с подвеской Bose так и не вышли на рынок. Также были разговоры об адаптации подвески для машин скорой помощи или роскошных туристических автобусов.

Сиденье Bose Ride System для водителей-дальнобойщиков использует аналогичную электромагнитную подвеску.

Сиденья для грузовиков с подвеской Bose

Пытаясь вывести на рынок пневматическую подвеску, компания Bose решила установить электронику и механическое оборудование внутри сидений, используемых водителями грузовиков дальнего следования.Предыдущий уровень развития техники — это сиденья с пневмоподвеской, которые смягчали езду, но этого было недостаточно для многих водителей грузовиков с проблемами спины.

В сиденье Bose Ride прецизионные датчики обнаруживают движение вверх и вниз. Запатентованные алгоритмы Bose рассчитывают, как отрегулировать сиденье, а электромагнитный двигатель в основании противодействует ударам. Место стоит 3700 долларов, меньше по количеству. При опросе водителей грузовиков, которые сообщили о проблемах со спиной, которые повлияли на их способность управлять тягачами с жесткой подвеской, 97 процентов заявили, что сиденье Bose значительно снижает дискомфорт.

ClearMotion принимает на себя Bose Project

Приобретение ClearMotion подвески Bose и технологии сидений Bose Ride может помочь ClearMotion разработать то, что она называет цифровым шасси. Не вдаваясь в подробности, ClearMotion заявляет, что выйдет за рамки нынешних адаптивных подвесок, использующих воздушное демпфирование или магнитореологические адаптивные демпферы (с использованием магнитных частиц в жидкости амортизатора, обычно называемой технологией MagneRide).

С добавлением портфеля Bose ClearMotion заявляет, что это «шаг ближе к достижению своей миссии — быть ведущей компанией в области управления движением в сфере мобильности.

Шакил Авадхани, генеральный директор и соучредитель ClearMotion. заявила, что будет масштабировать свои собственные технологии и технологии Bose на беспилотные платформы, потребительские внедорожники и пикапы, коммерческие грузовики, автобусы, сельское хозяйство и внедорожники. Он сказал, что пассажиры беспилотных автомобилей будут стремиться к плавной поездке, чтобы они могли работать на ноутбуке, планшете или традиционном бумажном блокноте в пути.

Bose sound — немецкий перевод — Linguee

В качестве дополнения включают подушки безопасности для коленей для

. […]

со стороны пассажира, биксеноновые фары, 18 дюймов

[…] сплав колеса el s , Bose sound s y st em, кража […]

сигнализация с замком и датчиком наклона,

[…] Доступна навигационная система

с 6,5-дюймовым цветным монитором, а также встроенная телефонная и телематическая система, CD-чейнджер (10-кратный) и Blue & Me — громкая связь Bluetooth с голосовым управлением и интерфейсом USB.

weber-auto.de

Als Sonderausstattung sind unter anderem der Knieairbag fr die

[…]

Beifahrerseite, Bi-Xenonscheinwerfer,

[…] 18-Zoll-Leichtmetallrd er , Bose-Soundsystem, Di ebstahl-warnanlage […]

mit Safe-Lock und Neigungssensor,

[…]

Navigationssystem с 6,5-Zoll-Farbmonitor плюс интегрированная система Telefon und Telematiksystem, CD-Wechsler (10-fach) и Blue & Me — einer Bluetooth-Freisprecheinrichtung mit Sprachsteuerung und USB-Schnittstelle — erhltlich.

weber-auto.de

Поставляется в прочном транспортировочном кейсе из алюминия и дерева с роликами,

[…] проекторы, ПК и t h e Bose sound s y st em хорошо защищены […]

в прочном корпусе.

more3d.com

In einem stabilen Alu-Holz-Flightcase,

[…]

das mit Rollen geliefert wird, sind die Projektoren,

[…] der PC u nd di e B ose -Sound-A nla ge beste ns geschtzt […]

untergebracht.

more3d.com

высококачественный твитер с мягким куполом в

[…]

стандартное крепление приборной панели »может быть

[…] комбинированный wi t h Bose sound s y st em «2 way […] Система

со специальной схемой кроссовера

[…]

настройки «очень однородный и пространственный звук» удивительно мощный низкий бас

jehnert.com

hochwertiger Softdome-Hochtner в

[…]

werkseitiger ffnung im Armaturenbrett «

[…] kombinierba r mit B ose -Sound- Sys tem « 2 -Wege-System […]

mit spezieller Frequenzweichenanpassung

[…]

fr sehr homogenes und rouliches Klangbild «erstaunlich druckvoller Tiefbass

jehnert.com

Имея со вкусом оформленную индивидуальную планировку и интерьер, владелец уделил время и подумал обо всех аспектах. 3 двухместные каюты и 2 двухместные каюты, все с

[…]

ванные комнаты. 3 гения, горячий

[…] ванна / спа, стабилизаторы a n d bose sound s y st em всего несколько […]

из множества дополнительных принадлежностей, которыми оснащена эта потрясающая лодка.

themanagementcompany.es

Nach einem geschmackvollen, Layout und mageschneiderten Interieur, hat der Besitzer Zeit verbringen und dachte in jeder Hinsicht. 3 Doppelkabinen und 2 Einzelbetten Kabinen, alle mit en -suite

[…]

Бадезиммер. 3 Geni ‘s, Эйн Whirlpool / Spa,

[…] Stabi li sato ren un d Bose Sound Sy ste m s ind n ur einige […]

der vielen, vielen Extras ausgestattet

[…]

, um dieses atemberaubende Boot.

themanagementcompany.es

Всем, кто желает испытать акустические качества аудио

[…]

систем, предлагаемых для нового Audi A4 до

[…] полный таз заказать t h e BOSE sound s y st em с компенсацией шума […]

и наслаждайтесь качеством звука, специально подобранным для вашего автомобиля.

schwab-kolb.com

Wer die Sound-Qualitten der Audio-Anlagen fr den neuen Audi A4

[…]

optimal erleben will, kann mit d em BOSE So undsystem eine auf das Fahrzeug abgestimmte,

[…] Fahrger us che kompensierend e Klangqualitt g enie e n.

schwab-kolb.com

ASR, бортовой компьютер, противотуманная фара, сервопривод, 4 места, 5 цилиндров, 2, 387 кубических сантиметров, 6 ходов, масса без груза в кг: 1650, гарантия 48 месяцев, специальная модель Edizione во славе знает с эксклюзивным кожаным оборудованием в природе , Би ксеноновый прожектор, Синий и

[…]

Me Navi с устройством громкой связи и

[…] USB-Embroider in g , Bose sound s y st em, панорамное стекло […]

крыша, алюминиевые диски 19 дюймов,

[…]

суппорты с красным лаком, алюминиевые спортивные педали, средняя консоль из темного алюминия и многое другое. Вы делаете покупки у официального дилера Alfa Romeo, который продает Alfa Romeo exclusiv в течение 35 лет.

zeisberg.autolot24.de

ASR, Bordcomputer, Nebelscheinwerfer, Servo, 4 Sitzer, 5 Zylinder, 2387 ccm, 6 Gang, Leergewicht в кг: 1650, 48 Monate Garantie, Sondermodell Edizione in glory wei mit exclusiver Lederausstattung in Natur, Bi- Xenonscheinwer30003 […]

& Me Navi mit Freisprecheinrichtung

[…] und U SB — Sti ck, Bose Soundsystem, Panor am a- Glasdach, […]

19 Zoll Alufelgen, rot Отсутствие

[…]

Bremssttel, Aluminium Sportpedale, Mittelkonsole в Dunklem Aluminium, u.v.m. Sie kaufen beim Alfa Romeo Vertragshndler, der seit 35 Jahren Alfa Romeo exclusiv verkauft.

zeisberg.autolot24.de

Оборудован wi t h BOSE sound s y st em, дисплей HUD, […]

Подушки безопасности водителя и переднего пассажира, сетка багажника, пакет памяти, регулируемый

[…] Руль

, многофункциональный руль, подогрев сидений спереди, салон черная кожа.

infinity-performance.de

Auerdem hat das

[…] Fahrzeug d as BOSE Звуковая система , HU D Дисплей, […]

Seitenairbag Fahrer und Beifahrer, Kofferraumnetz, Memory Paket,

[…]

verstellbare Lenksule, Multifunktionslenkrad, beheizte Sitze Fahrer und Beifahrer, Interieur Sonderfarbe Ebony

infinity-performance.de

Лифты и люк на крыше 65 0 , Bose sound s y st em 680, автоматические чейнджеры […]

692, Raffledersitze впереди 982, Raffledersitze сзади 939

[…]

базовая комплектация: климат-контроль, электрические сиденья со стороны водителя Sitzmemory, звуковой пакет, спортивное рулевое колесо с 3 спицами и цветным гербом Porsche, электрически открывающаяся крышка багажника и крышка двигателя, с помощью пульта дистанционного управления можно открывать крышку багажника и обслуживать Sitzmemory , регулировка ширины с подсветкой, тормозной механизм большой емкости, 18-дюймовые обода с полыми спицами, 6-ступенчатая, электрическая система Fensterheber + Aussenspiegel, двойная подушка безопасности, зеркало для макияжа с подсветкой в ​​солнечных экранах, полный привод с Viscokupplung, Porsche Stability управление (ПСМ)

авто-салон-синген.autolot24.com

Hebe- / Sc hi ebeda ch 650 , Bose Sound Sys te m 68 0, C D- Wechsler […]

692, Raffledersitze vorne 982, Raffledersitze hinten 939 Grundausstattung:

[…]

Клима, электрический Sitze мит Sitzmemory FAHRERSEITE, Klangpaket, Dreispeichen-Sportlenkrad мит farbigem Porsche- Wappen, Elektrisch entriegelbarer Kofferraum- унд Motordeckel, бер умереть Fernbedienung канн Kofferraumdeckel geffnet унд Sitzmemory bedient Werden, Leuchtweitenregulierung, Hochleistungsbremsanlage, 18»Hohlspeichen-Felgen, 6 -Gang, elektrische Fensterheber + Auenspiegel, Doppelairbag, beleuchtete Make Up-Spiegel in den Sonnenblenden, Allradantrieb mit Viscokupplung, Porsche Stability Management (PSM)

авто-салон-синген.autolot24.com

Например, туалеты с автоматической самоочисткой оснащены

[…] характер iz e d BOSE sound s y st em музыка, […]

Духи DOLCE & GABBANA, КРИСТАЛЛ SWAROWSKI

[…]

внутреннее освещение и мониторинг / управление GSM.

euromodul.org

Zum Beispiel in selbstreinigenden

[…]

Sanitreinheiten aus der eXceptional Kollektion

[…] finden w ir : BOS E suond s ystem m usic, DOLCE […]

и ГАББАНА Люфтерфришер, SWAROWSKI CRYSTAL

[…]

innere Beleuchtung, GSM Leitung

euromodul.org

Если повезет, вы выиграете одну из десяти

[…]

привлекательных приза: Apple MacBook,

[…] Canon EOS 400 D, a BOSE-Sound D o ck , iPod Classic, […]

Canon IXUS 70, фото Ality

[…]

Frame 8 «или один из четырех купонов ARAL на бензин стоимостью 20 евро.

wini.eu

Mit viel Glck gewinnen Sie einen von zehn attktiven

[…]

Цена: ein Apple MacBook, eine Canon

[…] EOS 4 00 D, ei n B OSE -Sound- Doc k, einen i Pod Classic, […]

eine Canon IXUS 70, ein Ality Photo

[…]

Рама 8 дюймов или Einen von vier ARAL-Tankgutscheinen im Wert от 20 евро.

wini.eu

Его роскошное стандартное оборудование включает

[…] 20-дюймовые колеса s, a Bose sound s y st em и многие […]

дополнительных функций.

schwab-kolb.com

Zu seiner luxurisen Serienausstattung gehren

[…] 20-Zoll-Rder, ei ne Bos e-Soundanlage u nd v ie le weitere […]

Особенности.

schwab-kolb.com

Премиум

[…] пакет развлечений wi t h Bose sound s y st em, Playstation […]

III и 40-дюймовый плоский экран за стеклянной стеной вокруг

[…]

от эксклюзивной атмосферы в гостиной.

ketterer-trucks.de

Ein hochwertiges

[…] Entertainment-Packag e mit Bose- Soundsystem , Pla ys tation […]

III и 40-дюймовый плоский экран hinter einer Glaswand vervollstndigt

[…]

— эксклюзивный Wohnathmosphre.

кеттерер-траков.de

Двигатель

====== — V12 TDI с рабочим объемом шесть литров, мощностью 368 кВт (500 л.с.) и крутящим моментом 1000 Нм (737,56 фунт-фут) — Система впрыска Common Rail с максимальным давлением 2000 бар для высокотехнологичной эксплуатации и плавное сгорание — 0-100 км / ч (62,14 миль / ч) за 5,5 секунды, максимальная скорость 250 км / ч (155,34 миль / ч, с электронным ограничением). с превосходным комфортом переключения — полный привод quattro с динамическим разделением крутящего момента Шасси ======= — Адаптивная пневматическая подвеска и амортизаторы с электронным управлением в стандартной комплектации — 20-дюймовые колеса с возможностью установки 21-дюймовых колес — Высокая производительность дисковые тормоза из углеродистой керамики в стандартной комплектации Дизайн ====== — Значительные изменения внешнего дизайна — Кожаные сиденья, вставки из углеродного волокна

[…]

Интерьер ========= — Спортивное, роскошное оборудование, сиденья с электроприводом

[…] регулируется и нагревается te d , Bose sound s y st em, электрический […]

крышка багажника

schwab-kolb.com

Двигатель ===== — V12-TDI mit sechs Liter Hubraum, 368 кВт (500 л. 5,5 Sekunden, Hchstgeschwindigkeit 250 км / ч (abgeregelt) Kraftbertragung ================ — Verstrkte Sechsstufen-tiptronic mit hohem Schaltkomfort — Allradantrieb quattro mit Dynamischer Momentenverteilung Fahrwerk ===== === — Адаптивная пневматическая подвеска Luftfederung и электронная подвеска Dmpfer Serie — Rder im Format 20 Zoll, auf Wunsch auch in 21 Zoll — Hchstleistungs-Scheibenbremsen aus Kohlefaser-Keramik Serie Design ====== — Markante nderungen am Auzeendesign Lederbezgen, Dekoreinlagen aus Carbon Ausstattung =========== —

[…]

Sportlich-luxurise Ausstattung, Sitze elektrisch verstell-

[…] un d beheizb ar, Soundsystem от Bose , elektrische […]

Gepckraumklappe

schwab-kolb.com

Включено в

[…] упаковка e i s Bose sound , n av igation system, […]

круиз-контроль, затемняющее зеркало заднего вида и датчик дождя.

motorvision.de

Serienmig gibt es

[…] unter ander em Bos e-Sound, ein Na vigationssystem, […]

Tempomat, abblendbare Spiegel und einen Regensensor.

motorvision.de

A un iq u e Bose звук s y st em отфильтровывает внешний шум и обеспечивает превосходный звук даже на максимальной скорости, так что вы все еще можете иметь идеальный саундтрек […]

с убранной крышей,

[…]

, а навигационная и интерактивная компьютерная система нового поколения позволяет сосредоточиться на поездке.

infiniti.be

Ein einzi ga rtig es Bose Sound- Syst em f il tert Auengerusche und bietet auch bei hohen Geschwindigkeiten ein en groartigen soda, soda, Sie auch […]

mit zurckgeklapptem

[…]

Verdeck den perfekten Sound genieen knnen. Das Navigations- и интерактивная компьютерная система вернет новую технологию и ее продвижение, sich voll und ganz auf die Fahrt zu konzentrieren.

infiniti.at

Интегр на e d Звук Bose s y st em с 21 […] Динамики

превращают интерьер Maybach в мобильный концертный зал.

arlbergexpress.com

Ein in tegri ert es Bose- So und ystem v erwandelt […]

den Innenraum des Maybach, в районе Einen Mobilen Konzertsaal mit 21 Lautsprechern.

arlbergexpress.com

Можно рассчитывать на: grand

[…] фортепиано, световой эффект ct s , Bose-sound s y st em, радиомикрофоны, […]

видео- и DVD-проектор

[…]

профессионально обученным оператором, гардероб для художников.

newlivinghome.de

Mit folgenden Komponenten knnen Sie planen:

[…] Steinway-Flgel, Li ch teffe kte , Bose -Sound- Sys tem , Fun km ikrofone, […]

Профессиональный видео- и DVD-проигрыватель

[…]

bedient durch den hauseigenen Veranstaltungstechniker, Knstlergarderobe, Mitbenutzung des Foyers und weiterer grozgiger Rume nach Absprache.

newlivinghome.de

В нашем отеле Petersboden вы найдете наш

[…]

MediaCaf. Он оснащен пятью рабочими станциями с быстрым доступом в Интернет, 42-дюймовым

[…] плазменный дисплеем la y , Bose sound s y st em и лаунж-зону.

petersboden.at

In unserem Hotel Petersboden finden Sie unser

[…]

MediaCaf — ausgestattet mit fnf schnellen Internet-Workstations, einem

[…] 42 «-Plasma di splay , Bose -Sound und eine r Lounge-Area.

petersboden.at

BOSE 5 звук s y st em с соответствующими бесплатными аудио плагинами.

prekmurska-gostilna.si

Lautsprecheranlage BOSE 5 mit entsprechenden freien Audio-Anschlssen

prekmurska-gostilna.si

Помимо штатной магнитолы / проигрывателя компакт-дисков

[…] и «prem iu m » Bose sound s y st em, A4 […]

оснащен громкоговорителями и усилителями B&O.

автожурнал.co.uk

Neben dem Standard-Radio / CD-Spieler

[…] und der «до mi um» Bose-Ste re oanlage ist […]

der A4 mit Lautsprechern und Verstrkern von B&O zu haben.

autozine.de

Жилая площадь имеет большое рабочее пространство, собственное

[…] гардеробная ob e , Bose sound s y st em, щедрый […]

диван / кресло и отдельная терраса.

[…]

Это множество отличных удобств, которые делают этот люкс современным и прилично оформленным.

grand-elysee.com

Der Wohnraum ist mit einem grozgigen

[…]

Arbeitsbereich ausgestattet, ein begehbarer

[…] Kleiderschrank, e in e Bose-M us ikanlage, der […]

Grozgige Couch- / Sessel-Bereich sowie

[…]

die eigene Terrasse zhlen zu den vielen vorzglichen Annehmlichkeiten dieser modern und dezent gestalteten Suite.

grand-elysee.com

Специальное оборудование: Parctronic 220, крыша Glass-Sun-Lifting, сигнализация

[…] Система

, огнетушитель, MB Audio 10

[…] с CD-чаном ge r , Bose sound s y st em, сотовый телефон […]

держатель, электрические жалюзи, ксеноновые фары с системой очистки

автосалон-синген.de

Sonderausstattung: Parctronic 220, Glas-Schiebe-Hebedach,

[…]

Einbruchdiebstahlwarnanlage, Feuerlscher, MB Audio 10 mit

[…] CD-Wec hs ler, Bose Soundsystem, H andy-Halterung […]

mit Freisprecheinrichtung, elekrischer

[…]

Rollo, Xenon-Scheinwerfer mit Scheinwerferreinigung.

autosalon-singen.de

Комбинированная микроволновая печь / обычная духовка / гриль Холодильник Глубокая заморозка Коктейльный шкаф с холодильником Icemaker Flybridge wetbar, включая раковину и электрическое барбекю Холодильник Flybridge Посудомоечная машина Прачечный центр Vacuflush

[…]

туалеты со сборным баком Салон LCD TV

[…] с DVD a n d Bose s u rrou n d звук s y st em ЖК-телевизор / DVD / радио […]

в обеих каютах Флайбридж

[…]

Стерео CD / радио Тиковая транцевая платформа / палуба кокпита / лестница на флайбридже / лестница на боковые палубы Боковые палубы и флайбридж с тиковым покрытием Шезлонги и подушки на флайбридже Дверь рулевого на правую боковую палубу Открывающаяся дверь на левую боковую палубу Двери салона с каркасом из нержавеющей стали Кран с флайбриджем с местом для хранения тендеров и мотоциклов (также простирается на транце) Телескопический трап с дистанционным управлением Транцевая дверь Транцевый душ с горячей и холодной водой Полностью оборудованная кабина экипажа Ночные чехлы в кокпите

spreemarine.de

Gefrierschrank Cocktailschrank mit Khlschrank Eiswrfelbereiter Flybridge-Bar с интегрированным Sple и электрическим барбекю-грилем Khlschrank на флайбридже Geschirrsplmaschine

[…]

Туалетная вода Waschkchenbereich Vacuflush mit

[…] Резервуар L CD -TV / DVD un d Bose-S ur roun dsys te m im Салон […]

LCD-TV / DVD / Radio в beiden Suiten

[…]

Stereo-CD / Radio auf Flybridge Teakholzbelag auf Seitendecks und Flybridge Teakholzbelag auf Transomplattform / Cockpitdeck / Treppe zu Flybridge und Treppe zu Seitendecks Flybridge-Sonnenliege und Treppe zu Seitendecks Flybridge-Sonnenliege und Flypolster Tr zum Seitennger-Seitendeck BereniRudee-Stroe-Zum fr Beiboot und Wetbike (reicht ber Transomplattform) Fernbediente ausfahrbare Gangway Transomtr Warm-und Kaltwasserdusche auf Transomplattform Voll ausgestatte Crewkabine Abdeckplane fr Cockpit

spreemarine.de

Соглашение о сотрудничестве заключено wi t h Bose , t he U. S . звук a n d специалист по аудио, является основным стратегическим […]

первого полугодия 2001 года.

loewe.fi

Strategisch es Highlight im ersten Halbjahr 2001 war die Kooperationsvereinbarung mit dem amer ik anisc hen Sound- un d Aud io Spezialisten Bose.

loewe.de

Оберните себя

[…] в чистом виде и до ci s e звук o f t he 16-spe ak e r Bose S ur r или n d Звук S y st em с 5.1-канальный […] Декодирование

(стандарт

[…]

для классов GT Premium и S Premium и опционально для классов GT и S).

infiniti.ch

Freuen Sie

[…] sich auf ei n Sounderlebnis d er besonderen Art: das 5.1-Kanal Bose S ur round Sound Syste m mit 16 […]

Lautsprechern (серия

[…]

в den GT Premium и S Premium Modellen, опционально для GT и S).

infiniti.at

Предлагается в стандартной комплектации, t h e BOSE S ur r or n d Sound S y st em с 14 динамиками […]

имеет повышенную выходную мощность 410 Вт и теперь поддерживает

[…]

воспроизведения музыки с аудио и видео DVD в 5.1 Дискретный формат объемного звучания.

www12.porscheengineering.com

D как серийный BOSE S urr или nd Sound-Sy st em mit 1 4 Lautsprechern […]

verfgt ber eine gesteigerte Nennleistung von 410 Watt

[…]

и звукозаписи с аудио или видео DVD с музыкой в ​​формате 5.1 Discrete Surround.

www12.porscheengineering.com

Кульминацией вечера стал

. […]

tombola и ее привлекательные цены, такие как

[…] например t h e Bose W av e Звук S y st em, и [.. .]

интервью с легендами гонок, Ханс

[…]

Херрманн и Дерек Белл, которые рассказали о своей страсти к Porsche.

www12.porscheengineering.com

Hhepunkte des Abends Waren die Tombolaverlosung

[…]

mit attaktiven Preisen, wie

[…] beispielsweise da s Bo se W av e Sound S ys tem, und d ie Интервью […]

mit den Rennfahrerlegenden Hans

[…]

Herrmann und Derek Bell, die ber ihre Leidenschaft fr Porsche sprachen.

www12.porscheengineering.com

В обширное стандартное серийное оборудование 911 Turbo Cabriolet также входят биксеноновые фары, 19-дюймовые кованые диски с двухцветным дизайном, кондиционер, ветрозащитный экран, Porsche Communication

. […]

Управление (PCM) — с навигационным модулем и 5,8 дюймовым цветным

[…] монитор и t h e Bose S u rrou n d Звук S y st em , среди […]

другое.

www12.porscheengineering.com

Zur umfangreichen Serienausstattung des 911 Turbo Cabriolets zhlen unter anderem Bi-Xenon-Scheinwerfer, 19-Zoll-Schmieder in Bi-Color-Optik, eine Klimaautomatik, das Windschott, das Porsche

[…]

Управление коммуникациями (PCM) einschlielich Navigationsmodul und

[…] 5,8-Zoll-Farbbildschirm s owie das Bose Sur rou nd-Sound-Sy ste m .

www12.porscheengineering.com

С CD-чейнджером на шесть дисков, совместимостью с MP3 и полным комплектом

[…]

одиннадцать динамиков, в том числе 25 см

[…] НЧ динамики Infi ni t i Bose p remi u m звук s y st em обещает […]

— незабываемые впечатления от прослушивания.

infiniti.co.uk

Mit Sechsfach-CD-Wechsler, MP3-Anschluss und elf Lautsprechern,

[…]

darunter 25 см groe Tieftonlautsprecher, verspricht

[…] das Inf in iti Bose pre mi um sound sy st em e in u nv ergessliches […]

Musikerlebnis.

инфинити.de

Улицы Бостона с выбоинами вдохновляют сиденья грузовика Bose — Boston Overdrive

Термин «грузовик» может напоминать памятные моменты из песни Grateful Dead 1970 года, радио CB или, возможно, печально известного мультипликационного персонажа Роберта Крамба 1968 года, который откидывается назад с вытянутой ногой и поднятым вверх большим пальцем.

Люди за рулем говорят, что это работа, которая живет глубоко в душе. Но для многих тяготы грузоперевозок буквально отражаются в позвонках водителя.Куда бы он ни пошел, он натыкается на неровности дороги и может страдать от так называемой «вибрации всего тела».

Когда инженер Джим Парисон ехал с водителем, несущим награду Bose, он был потрясен ударом по тротуару на Атлантик-авеню в Бостоне.

«Мы были поражены неровностями, которые стандартная подвеска под сиденьем не могла поглотить», — вспоминает главный инженер Bose Майк Розен. «Мы ушли, думая, что должен быть лучший способ, и мы могли бы использовать наши технологии, чтобы помочь.«

При обычной установке сиденья, когда сила давит на пружину, она толкает назад. Водитель находится в постоянном движении, поскольку пружины смягчают силу, но никогда не противодействуют ей. Актуатор Bose Ride улавливает и противодействует волнам или вибрациям от дороги.

«Когда грузовик врезается в выбоину, Bose Ride распознает это, поскольку пол кабины ускоряется вниз. Компьютер сообщает линейному актуатору, что необходимо приложить восходящую силу, чтобы водителю было удобно преодолевать выбоину», — объясняет Розен.«На другом конце сила будет толкать вверх, и привод скажет креслу опуститься вместе с полом грузовика, удерживая водителя ровно».

Bose Ride также можно выключить — и часто это происходит, когда водители загоняют трейлеры во дворы, действуя как обычное сиденье OEM, превращая его в два сиденья в одном.

После пяти лет и 100000 часов секретных дорожных испытаний, Bose Ride постоянно получала два отчета от водителей: их время в машине было менее утомительным, и они не проводили «время простоя» дома, пытаясь восстановить свои силы. следующий рейс.

«Типичный тестовый образец был помещен в грузовик на месяц, — говорит Розен, — и нас поразило, что это имело такое влияние. Сообщалось о реальных проблемах с качеством жизни, и эти проблемы приводили к расходам. для грузовой отрасли.

«Я уверен, что доктор Бозе никогда не ожидал, когда он начал работу над системой подвески автомобиля еще в 1980 году, что она может найти применение для кого-то, например, для грузовой отрасли».

Bose Ride будет демонстрироваться в лабораториях на торговых выставках по всей стране.«После 10–15 минут, проведенных с нами в мобильной лаборатории, они уже рядом с нами», — говорит Розен о тех, кто пробовал это на грузовиках.

Сиденья, произведенные во Фрамингеме, поступят в продажу в этом месяце по цене 5 995 долларов США и будут сначала предложены автопаркам, а затем будут проданы грузовикам-одиночкам. При весе около 180 фунтов (по сравнению с 100 фунтами обычного сиденья) Bose Ride имеет годовую гарантию. Работая от аккумуляторной батареи грузовика, он потребляет не больше энергии, чем требуется для питания 50-ваттной лампочки.

И нет, у него нет встроенных динамиков в сиденье. «Это один из самых распространенных вопросов, — смеется Розен, — из-за того, кто мы такие». Однако поездка — это музыка для дальнобойщика.

Джерри Майлзу можно связаться по адресу [email protected]

(PDF) Активная электромагнитная система подвески для улучшения динамики транспортного средства

Конференция IEEE по мощности и движению транспортных средств (VPPC), 3-5 сентября 2008 г., Харбин, Китай

978-1-4244-1849-7 / 08 / $ 25.00 ○

C2008 IEEE

Рис. 13. Структурная схема измерительной установки

Рис. 14. Временной интервал дорожных измерений (пассивных)

и внедорожного электромагнитного срабатывания на четверть вагона

испытательная установка ( активный)

тест драйв. Отслеживание исполнительного механизма, показанное на рис.

14, дает представление о динамических возможностях электромагнитного срабатывания

. Электромагнитный привод

имеет возможность приложения сил, эквивалентных системе пассивной подвески

, с очень малым временем отклика

(> 20 Гц).Следовательно, эта сила может быть добавлена ​​или вычтена из

сил пассивной подвески, чтобы получить

регулируемую систему подвески для устранения дорожных вибраций

.

VII. ВЫВОДЫ

В связи с изменением концепции транспортного средства на более

электромобиль, система подвески становится все более важной

из-за изменений в подрессоренных и неподрессоренных массах

. Системы активной электромагнитной подвески

могут поддерживать необходимую устойчивость и комфорт за счет способности

адаптации в соответствии с состоянием

автомобиля.Технические характеристики взяты из измерений на дороге и

на бездорожье для пассивной системы подвески,

, и можно сделать вывод, что для активного контроля крена необходимо максимальное усилие

4 кН и среднеквадратичное усилие 700 Н

для передних приводов. Кроме того, необходимая пиковая мощность демпфирования

составляет около 2 кВт, однако среднеквадратичная мощность демпфирования

составляет всего 16 Вт при обычной езде по городу.

Максимальный ход подъема и отскока составляет 80 мм и

58 мм соответственно.Дорожные измерения:

, имитированные на четверть автомобиля с помощью электромагнитного срабатывания

, а очень хороший отклик слежения

доказывает динамические характеристики системы электромагнитной подвески

.

БЛАГОДАРНОСТЬ

Авторы благодарят SKF за поддержку проекта

.

ССЫЛКИ

[1] D.N. Wormley, K.M. Бауэр и Дж.Э. Бернард, «Национальная система оценки безопасности дорожного движения

для сопротивления опрокидыванию

», Транспортный исследовательский совет, Tech.Rep., 2002.

[2] http://www.essent.eu, «Essent ускоряет массовое использование электрических автомобилей

», 2008.

[3] К. Чакир и А. Сабанович, «Ин- конструкция колесного двигателя для электрических транспортных средств

», 9-й международный семинар IEEE по Advanced Motion

Control, стр. 613-618, 2006 г.

[4] С. Зеттерстрём,« Электромеханическое рулевое управление, подвеска, привод и тормозные модули

. , ”Труды конференции IEEE Vehicular Technology

, т.3, pp. 1856-1863, 2002.

[5] J.J.H. Паулидес, Л. Энсика, Э.А. Ломонова, А. Vandenput,

«Конструктивные соображения полуактивной электромагнитной системы подвески

», IEEE Transactions on Magnetics, vol. 39, нет.

6, pp.1681-1688, 2003.

[6] A.J. Бенсон, «Морская болезнь», Стеллман Дж. М. и др., Ред.

Энциклопедия по охране труда. 4-е изд. Женева:

Международное бюро труда, 1998: 50.12-4.

[7] G.R. Барнс и Б. Ранс, «Движение головы, вызванное

угловыми колебаниями тела по осям тангажа и крена», Aviat

ion, Космическая и экологическая медицина, вып. 46, pp. 987-93,

1975.

[8] L.J. Smart, T.A. Стоффреген и Б. Барди, «Визуально индуцированная болезнь движения

, предсказанная постуральной нестабильностью», Human Factors,

44 (3), 451-465, 2002.

[9] L.H. Frank, J.G. Casali и W.W. Вервилле, «Влияние задержек визуального отображения

и систем управления движением на производительность оператора и беспокойство

в симуляторе вождения», Human Factors, 30, 201–217,

1988.

[10] E.C. Regan, K.R. Прайс, «Частота появления и тяжесть

побочных эффектов погружения в виртуальную реальность», Aviation,

Space and Environmental Medicine, vol. 65, 527–530, 1994.

[11] Y. Yoo, G.C.H. Ли и С. А. Джонс, «Vection, компенсирующее колебание

и болезнь симулятора», In B. Dos & W. Karowski (Eds.),

, Достижения в профессиональной эргономике и безопасности, стр. 589–592,

1997.

[12] стр.M. Gahlinger, «Морская болезнь — как помочь своим пациентам

избежать мучений в дороге», Интернет-аспирантура по медицине, Vol. 106, No.

4, 1999.

[13] JR Lackner, «Морская болезнь», В: Энциклопедия

Neuroscience, 3-е издание, версия на компакт-диске, G. Adelman, B.

Smith (ред. ). Амстердам: Elsevier Science, 2003.

[14] М. Страсбергер и Дж. Гулднер, «Динамический привод BMW: система активного стабилизатора поперечной устойчивости

», IEEE Control Systems Magazine,

vol.24, вып. 4, pp. 28-29, 2004.

[15] Модуль Sachs ABC. [онлайн]. Доступно: http://www.zfsachs.com.

[16] У.Д. Джонс, «Легкая езда: Bose Corp. использует технологию динамиков для

, чтобы придать автомобилям адаптивную подвеску», IEEE Spectrum, vol. 42, нет. 5, pp

12-14, 2005.

[17] B.L.J. Gysen, J.L.G. Janssen, J.J.H. Паулидес и Э. Ломонова,

«Аспекты проектирования системы активной электромагнитной подвески

для автомобильной промышленности», 43-е ежегодное собрание IEEE IAS,

Октябрь 2008 г.

[18] А. Кручек и А. Стрибрский, «Полная модель автомобиля с активной подвеской

— Некоторые практические аспекты», Материалы Международной конференции по мехатронике IEEE

, стр. 41-45, июнь 2004 г.

[19] Р. Кросс, «Роль центробежной силы в крене транспортного средства», American

Journal of Physics, vol. 67, нет. 5, стр. 447-448, 1998.

[20] П. Сюй, «Свойство рекуперации энергии в системах с электрической активной подвеской

», Труды конференции Energy Conversion Engineering

, том.3, pp. 1899–1904, 1996.

Разрешенное лицензионное использование ограничено: Технологический университет Эйндховена. Загружено 8 апреля 2009 г. в 08:22 с IEEE Xplore. Ограничения применяются.

Условия использования

Сервисы принадлежат и управляются Bose и содержат материалы (включая все программное обеспечение, дизайн, текст, редакционные материалы, информационный текст, фотографии, иллюстрации, аудиоклипы, видеоклипы, иллюстрации и другие графические материалы, а также названия, логотипы, товарные знаки и знаки обслуживания), которые полностью или частично получены из материалов, предоставленных Bose и ее партнерами, а также некоторыми третьими сторонами, и защищены законами об авторском праве, положениями международных договоров, товарными знаками, знаками обслуживания и другими законами об интеллектуальной собственности.

Вы соглашаетесь соблюдать все применимые законы об авторском праве и другие законы. Вы признаете, что Услуги были разработаны, скомпилированы, подготовлены, пересмотрены, отобраны и упорядочены компанией Bose и другими посредством применения методов и стандартов суждения, разработанных и примененных за счет значительных затрат времени, усилий и денег, и представляют собой ценный интеллектуальный ресурс. собственность Bose и другие подобные.

Вы соглашаетесь защищать права собственности Bose и всех других лиц, имеющих права на Сервисы, в течение и после срока действия настоящих Условий, а также выполнять все разумные письменные запросы, сделанные Bose или ее поставщиками и лицензиарами (совместно именуемые «Поставщики»). контента или иным образом для защиты своих и других договорных, законодательных и общих прав в отношении Услуг.Вы соглашаетесь немедленно уведомлять Bose о любых претензиях о том, что Услуги нарушают какие-либо авторские права, права на товарные знаки или другие договорные, законодательные или общие права.

Все настоящие и будущие права на коммерческую тайну, патенты, авторские права, товарные знаки, знаки обслуживания, ноу-хау и другие права собственности любого типа в соответствии с законами любого государственного органа, национального или иностранного, включая, помимо прочего, права на и в отношении всех приложений и регистраций, относящихся к Услугам, в отношениях между вами и Bose всегда будет и останется единоличной и исключительной собственностью Bose.Любое несанкционированное использование любых материалов, содержащихся в Сервисах или через них, может нарушать законы об авторском праве, законы о товарных знаках, законы о конфиденциальности и публичности, а также правила и положения о коммуникациях.

Роль сигналов, опосредованных PKC / AP-1 и FOXM1

Абстракция

Фон

Кератин 15 (K15) — это кератин типа I, который используется в качестве маркера стволовых клеток. Его экспрессия ограничена базальным слоем многослойного эпителия и выпуклостью в волосяных фолликулах.Однако в определенных клинических ситуациях, включая красный плоский лишай ротовой полости, K15 индуцируется в супрабазальных слоях, что несовместимо с ролью маркера стволовых клеток. Это исследование дает представление о механизмах экспрессии K15 в базальных и дифференцирующихся кератиноцитах.

Методология / основные выводы

Кератиноциты человека были дифференцированы тремя различными методами; суспензия в метилцеллюлозе, высокая плотность клеток и обработка сложным эфиром форбола. Экспрессию мРНК определяли с помощью количественной ПЦР и белка с помощью вестерн-блоттинга и иммуноокрашивания.Кератиноциты в суспензии подавляли экспрессию β1-интегрина, индуцировали специфичные для дифференцировки маркеры и K15, тогда как FOXM1 (белок, регулируемый клеточным циклом) и K14 подавлялись. Восстановление β1-интегрина либо фибронектином, либо пептидом аргинин-глицин-аспартат подавляло K15, но индуцировало экспрессию K14 и FOXM1. Специфическое ингибирование PKC с помощью siRNA и фактора транскрипции AP-1 с помощью TAM67 (доминантно-отрицательный c-Jun) подавляло экспрессию K15, предполагая, что путь PKC / AP-1 играет роль в специфической для дифференцировки экспрессии K15.Специфическая для базальных клеток экспрессия K15 может включать FOXM1, поскольку известно, что эктопическая экспрессия последнего индуцирует K15. Используя иммунопреципитацию хроматина, мы идентифицировали единственный связывающий мотив FOXM1 в промоторе K15.

Выводы / Значение

Данные свидетельствуют о том, что K15 индуцируется во время терминальной дифференцировки, опосредованной понижающей регуляцией β1-интегрина. Однако это не может быть механизмом специфической для базальных / стволовых клеток экспрессии K15 в многослойном эпителии, потому что базальные кератиноциты не подвергаются терминальной дифференцировке.Мы предполагаем, что существует два механизма, регулирующих экспрессию K15 в многослойном эпителии; к дифференцировке, включающей путь PKC / AP-1, и базально-специфической, опосредованной FOXM1, и поэтому использование экспрессии K15 в качестве маркера стволовых клеток следует рассматривать с осторожностью.

Образец цитирования: Bose A, Teh M-T, Hutchison IL, Wan H, Leigh IM, Waseem A (2012) Два механизма регулируют экспрессию кератина K15 в кератиноцитах: роль сигналов, опосредованных PKC / AP-1 и FOXM1. PLoS ONE 7 (6): e38599.https://doi.org/10.1371/journal.pone.0038599

Редактор: Эндрю Йеудалл, Университет Содружества Вирджинии, Соединенные Штаты Америки

Поступила: 11 января 2012 г .; Принята к печати: 8 мая 2012 г .; Опубликовано: 27 июня 2012 г.

Авторские права: © 2012 Bose et al. Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

Финансирование: Работа была частично профинансирована Лондонским университетом королевы Марии в форме приза Амриты Боз для иностранных студентов-исследователей и Фонда лицевых исследований «Спасение лиц». Финансирующие организации не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Конкурирующие интересы: Авторы заявили, что никаких конкурирующих интересов не существует.

Введение

В эпидермисе базальные кератиноциты уникальны из-за их прикрепления к базальной мембране и составляют основную популяцию пролиферирующих клеток.Некоторые из базальных кератиноцитов являются стволовыми клетками, которые характеризуются своей долговечностью и клоногенностью. Эти клетки отвечают за гомеостаз тканей и регенерацию эпидермиса после травм [1], [2], [3], [4], [5], [6]. Когда стволовые клетки делятся, они продуцируют транзитно-амплифицирующие (ТА) клетки, которые обеспечивают постоянный запас «коммитированных» клеток для восполнения утраченных во время дифференцировки (обзор в [7]). Коммитированные кератиноциты подавляют регуляцию интегринов, чтобы они становились менее адгезивными, перемещаются в супрабазальный отсек и продолжают свое движение вверх до тех пор, пока они не будут окончательно дифференцированы [8] и не оторвутся.В результате образуются несколько слоев кератиноцитов на разных стадиях дифференцировки, которые создают защитный барьер. Различные слои эпидермиса можно идентифицировать по экспрессии кератинов, которые представляют собой очень большое семейство белков (49 генов в геноме человека [9]), которые образуют гетерополимеры типа I (кислотный) и типа II (основной / нейтральный). полипептиды в «мягком» и «твердом» эпителии [10]. Член каждого типа необходим для образования филаментов, и парная экспрессия очень специфична для дифференцировки.Например, базальные кератиноциты экспрессируют кератины K5, K14 и K15, тогда как дифференцирующиеся кератиноциты в эпидермисе экспрессируют кератины K1 и K10 [11], [12], а в слизистых оболочках они экспрессируют кератины K4 и K13 [13]. K6, K16, K9 и K17 экспрессируются в ладонно-подошвенном эпидермисе [14], а также в псориазе, гипертрофических и келоидных рубцах и в некоторых эпидермальных опухолях [15], [16]. Транскрипция базальных кератинов отключается, как только базальные кератиноциты перемещаются в супрабазальный компартмент с сопутствующей индукцией дифференцировочно-специфичных кератинов [11], [17].

K15 представляет собой кератин типа I, который не имеет своего собственного партнера по экспрессии типа II для сборки филаментов и разделяет партнера типа II, K5, с K14 [18]. Этот белок привлек внимание исследователей намного позже, потому что он был второстепенным компонентом эпидермиса и имел молекулярную массу, подобную K14, поэтому его можно было разделить только с помощью 2-D гель-электрофореза [11], [19]. Первое поликлональное антитело против K15 было описано в 1995/96 году для исследований тканевой экспрессии [18], [20].В более поздних работах использовались C8 / 144B, LHK15 и перекрестно реагирующие моноклональные антитела LC18N, которые установили, что K15 специфически экспрессируется в базальных кератиноцитах большинства стратифицированных эпителий [21], [22], [23].

В эпидермисе экспрессия K15 прерывистая у взрослых, с наиболее сильным окрашиванием в ретериджах и самым слабым в дермальных сосочках [21], [24]. Есть несколько доказательств того, что K15 является маркером стволовых клеток. Во-первых, K15 сильно экспрессируется в выпуклости по сравнению с остальной частью фолликула [21], [23], [25].Во-вторых, экспрессия K15 была использована для обнаружения лимбальных стволовых клеток на глазных поверхностях [26]. В-третьих, кератиноциты K15 + экспрессируют более низкие уровни проапоптотического гена Bax, но более высокие уровни антиапоптотических генов, чем клетки K15-, что согласуется с природой их стволовых клеток [24]. В-четвертых, промотор K15 был способен направлять β-галактозидазу к выступу [27], а клетки выступа, экспрессирующие управляемый промотором K15 GFP, воссоздали весь эпидермис и имели более высокий потенциал пролиферации [28]. В-пятых, клетки Lgr5 + в выпуклости, способные регенерировать весь фолликул, были K15 + [29].Эти наблюдения несовместимы с другими сообщениями, которые не поддерживают K15 как маркер стволовых клеток. Например, в волосяных фолликулах овцы K15 экспрессируется во внешней оболочке корня, за исключением выпуклости [30]. Более того, в эпителии слизистых оболочек экспрессия K15 непрерывна по всему базальному слою, и маловероятно, что каждая базальная клетка будет стволовой клеткой. Это может указывать на то, что в слизистой оболочке либо зона стволовых клеток расширилась, либо она гетерогенная, содержащая стволовые и не стволовые клетки, как в выпуклости [29], [31].Тем не менее, это указывает на то, что экспрессия K15 обнаруживает вариации в разных эпителиях видоспецифическим образом.

Сообщалось, что экспрессия K15 изменяется при большом количестве заболеваний человека, например, K15 увеличивается при базально-клеточной карциноме (BCC), но подавляется при плоскоклеточной карциноме [22], [32], [33] , [34]. В условиях гиперпролиферации, таких как заживление ран, патологические рубцы, а также в некоторых псориатических образцах, экспрессия K15 подавляется, что позволяет предположить, что клеточная среда внутри активированных кератиноцитов может не способствовать экспрессии K15 [21], [22], [35] ].Подавление K15 при воспалительных состояниях согласуется с сообщениями о подавлении транскрипции K15 специфическими для активации факторами роста и цитокинами, включая трансформирующий фактор роста-β, фактор некроза опухоли-α, эпидермальный фактор роста и фактор роста кератиноцитов [36]. . Эти сообщения также предполагают, что K15 не может быть надежным маркером стволовых клеток сам по себе, особенно в пораженном эпителии [35], [37].

Регулирование K15 сложнее, чем у других кератинов, и, по-видимому, зависит от присутствия других кератинов, особенно уровня K14.Например, повышенная экспрессия K15 наблюдалась у мышей с нокаутом K14, а также у пациентов с EBS, лишенных K14 [18], [20]. Уровень экспрессии K15 и его локализация в базальном слое также изменяется с возрастом [18], [38]. В некоторых стратифицированных эпителиях, таких как пищевод, и в определенных клинических ситуациях, таких как красный плоский лишай полости рта, K15 экспрессируется в надбазальных слоях [22], [39], [40]. Это, вместе с сообщениями об индукции синтеза K15 в кератиноцитах при высокой плотности клеток [22], [41], предполагает, что K15 также может экспрессироваться в дифференцирующихся кератиноцитах.При детальном анализе промотора K15 (область выше 1250 п.н.) Радоя с соавторами показали, что C / EBP-β, AP-1, тироидный гормон и IFN-γ индуцируют промотор K15, тогда как рецепторы ретиноевой кислоты, глюкокортикоидов, а NF-κB подавил его [42]. Эти исследования, хотя и очень информативны, не объясняют механизм базальной и супрабазальной экспрессии K15 в стратифицированном эпителии. До сих пор нет исследований, посвященных изучению молекулярного механизма, регулирующего дифференцировочно-специфическую экспрессию K15.Здесь мы представляем первое механистическое доказательство того, что экспрессия K15 может быть индуцирована дифференцировкой через PKCδ и AP-1. Мы также показали, что специфическая экспрессия K15 в базальных клетках (или стволовых клетках) включает другой механизм, возможно, опосредованный регулируемым клеточным циклом фактором транскрипции FOXM1. Это исследование поможет разрешить противоречивые литературные данные об экспрессии K15 и предостеречь от его использования в качестве маркера стволовых клеток.

Результаты

Индукция кератина K15 в дифференцировке кератиноцитов человека

Чтобы изучить регуляцию гена кератина во время дифференцировки, мы приостановили кератиноциты (N-Terts) в 1.3% (мас. / Об.) Метилцеллюлозы, и мы ожидали подавления генов K14 и K15, потому что оба были базально-специфическими кератинами. Однако, к нашему удивлению, мы наблюдали зависящее от времени подавление K14, но усиление транскрипции гена K15 (Fig. 1a). Чтобы продемонстрировать, что кератиноциты действительно подвергались дифференцировке в метилцеллюлозе, мы измерили ряд специфичных для дифференцировки генов K1, K10, корнифина и инволюкрина. Как показано на рисунке 1а, транскрипция генов, специфичных для дифференцировки, увеличивалась со временем и достигла максимума через 24 часа.Индукция транскрипции K10 и K15 обнаруживает лаг-фазу, которая отсутствует в других генах (Fig. 1a), указывая на то, что для их индукции, возможно, требуется синтез дополнительных факторов. Суспензия метилцеллюлозы, как известно, вызывает терминальную дифференцировку путем подавления β1-интегрина [8], [43]. Чтобы продемонстрировать, что дифференцировка кератиноцитов действительно опосредована β1-интегрином, мы измерили экспрессию β1 в суспендированных кератиноцитах. Как показано на рисунке 1b, более чем на 90% транскрипция β1-интегрина подавлялась после 24 часов суспендирования в метилцеллюлозе.Дифференцировка, индуцированная суспензией, увеличивала уровень K15, а также белков инволюкрина, в то время как белок K14 не подвергался значительному влиянию (рис. 1c). Это подтверждается данными иммунофлуоресцентного окрашивания, показанными на фиг. 2. Суспензия N-Terts отдельных клеток в метилцеллюлозе вызывает агрегацию клеток, которые гораздо сильнее окрашиваются на K15, инволюкрин и корнифин (фиг. 2). С другой стороны, суспензия не влияла на окрашивание K14.

Рисунок 1. Индукция экспрессии K15 в кератиноцитах, суспендированных в растворе метилцеллюлозы.

(a) N-Terts, растущие в SFM, суспендировали в DMEM + 20% FCS, содержащей 1,3% (мас. / Об.) Метилцеллюлозы. В разное время была выделена общая мРНК, преобразована в кДНК и использована для определения экспрессии K1, K10, корнифина, инволюкрина, K14 и K15 с помощью абсолютной КПЦР в реальном времени. (b) Подавление β1-интегрина после 24 ч инкубации N-Terts в метилцеллюлозе. (c) Экспрессия белка K15, K14 и инволюкрина вестерн-блоттингом после инкубации N-Terts в суспензии через 0 и 24 часа.(d) Влияние 100 мкг / мл фибронектина на динамику дифференцировки кератиноцитов, измеренную по экспрессии K15, K14, корнифина и FOXM1B. (e) Сравнение фибронектина (Fib) и пептида RGD (RGD) на транскрипцию генов в суспензионной культуре через 0 и 24 часа. Клетки 0 ч использовали для экстракции мРНК вскоре после трипсинизации перед суспендированием в метилцеллюлозе. Каждая полоса представляет собой среднее значение ± SEM, где n = 3. (P <0,01, очень значимо, **; P <0,001, чрезвычайно значимо, ***).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0038599.g001

Рис. 2. Индукция K15 в терминально дифференцированных кератиноцитах N-Tert.

N-Terts, растущие в SFM, суспендировали в DMEM + 20% FCS, содержащей 1,3% (мас. / Об.) Метилцеллюлозы. Через 24 ч клетки собирали и промывали PBS перед суспендированием в 20–30 мкл FCS. Аликвоту 3–4 мкл наносили штрихами на предметные стекла. В то же время только что обработанные трипсином N-Terts также наносили штрихами и использовали в качестве 0-часового контроля.Клетки сушили на воздухе, фиксировали в формальдегиде и иммуноокрашивали различными моноклональными антителами, как описано в разделе «Материалы и методы». К15 (а, б), К14 (в, г), инволукрин (д, е), корнифин (г, з). Все слайды были сфотографированы при одинаковом увеличении. Клетки в b, d, f и h было трудно сфокусировать, потому что они подверглись агрегации в метилцеллюлозе (полоса увеличения = 20 мкм).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0038599.g002

Когда N-Terts выращивали в среде RM +, содержащей в 50 раз больше EGF, чем SFM, профиль экспрессии стал двухфазным, начальным де- фаза дифференциации, за которой следует фаза дифференциации (рис.S1a). Замена N-Terts нормальными первичными эпидермальными или иммортализованными кератиноцитами человека (HaCaT) в суспензионной культуре изменяла только уровень индукции гена, не влияя на общий характер индукции K15 или экспрессии маркеров дифференцировки (рис. S1b).

Подавление экспрессии K15 в суспензионной культуре фибронектином и пептидом RGD

Было показано, что взаимодействие β1-интегрина с фибронектином подавляет индуцированную метилцеллюлозой терминальную дифференцировку кератиноцитов [43].Чтобы продемонстрировать, что экспрессия K15 действительно была чувствительна к дифференцировке кератиноцитов, мы добавили 100 мкг / мл фибронектина в суспензионную культуру, которая подавляла терминальную дифференцировку, как показано снижением уровня мРНК корнифина (рис. 1d). Экспрессия FOXM1 (изоформа B), которая, как известно, подавляется в начале дифференцировки [44], увеличивалась фибронектином, подтверждая, что дифференцировка подавляется. Интересно, что экспрессия K15 также подавлялась фибронектином (рис.1г), предполагая это.

Экспрессия

K15 была чувствительна к дифференцировке в этих условиях. Эффект фибронектина воспроизводился пептидом 5 мкМ аргинин-глицин-аспартат (RGD), который, как известно, имитирует фибронектин [43], [45], за исключением того, что пептид был более эффективным, возможно, из-за его низкой молекулярной массы. Как и ожидалось, экспрессия K14 и FOXM1B, которые снижены в суспензии, увеличивалась фибронектином и пептидом (рис. 1e).

Индукция экспрессии K15 при высокой плотности кератиноцитов

Сообщается, что

кератиноцитов дифференцируются при высокой плотности клеток [41].Чтобы исследовать, как дифференцировка кератиноцитов, индуцированная плотностью клеток, влияет на экспрессию K15, мы измерили мРНК K15 в N-Terts, культивируемых до высокой плотности. Мы наблюдали, что при низком содержании кальция (0,09 мМ) транскрипция K10, K1 и корнифина увеличивалась в 1774, 120 и 120 раз соответственно, поскольку плотность клеток увеличивалась с 20 до 95% (рис. 3a). Базальные кератины K14 и K15 также индуцировались при высокой плотности клеток, причем K15 демонстрировал гораздо более высокую экспрессию (в 14 раз), чем K14 (в 5,1 раза). Экспрессия FOXM1B была немного снижена (примерно на 10%), когда плотность клеток приближалась к слиянию.Эта картина осталась неизменной при 1,8 мМ кальция (рис. 3b).

Рисунок 3. Индукция транскрипции K15 в кератиноцитах, культивируемых при увеличивающейся плотности клеток.

N-Terts, растущие в SFM при низких (0,09 мМ) (а) и высоких (1,8 мМ) (б) концентрациях кальция, позволяли достичь желаемого слияния перед использованием для экспрессии K1, K10, K14, K15, корнифина. и FOXM1B. В (c) N-Terts с низким содержанием кальция (0,09 мМ) высевали с необходимой плотностью, давали возможность прикрепиться в течение 24 часов, после чего их использовали для измерения уровней мРНК с помощью кПЦР.Каждая полоса представляет собой среднее значение ± SEM, где n = 3.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0038599.g003

Чтобы выяснить, достаточно ли увеличения межклеточного взаимодействия / адгезии для запуска дифференцировки и экспрессии K15, мы высевали N-Terts с разной плотностью (от 20 до 100%) с низким содержанием кальция (0,09 мМ) и через 24 часа проанализировали экспрессию K1, K10, корнифина, K14, K15 и FOXM1B. Как показано на фиг. 3c, картина экспрессии была почти идентична той, которая наблюдалась, когда клеткам давали возможность расти в течение нескольких дней для достижения слияния.

Сравнение экспрессии белка в N-Terts проводили при низкой и высокой плотности клеток с использованием иммунофлуоресцентного окрашивания. Как показано на фиг. 4, клетки с низкой плотностью экспрессировали пониженный K15 (фиг. 4, сравните a с b), но экспрессия инволюкрина (фиг. 4e, f) существенно не различалась при низкой и высокой плотности клеток. Экспрессия K14 значительно снижалась при высокой плотности клеток (рис. 4c, d). Клетки при низкой плотности экспрессировали K15 в виде небольших глобул, распространяющихся по цитоплазме, тогда как при высокой плотности клеток преимущественно наблюдалось окрашивание только филаментов (рис.4и, к).

Рисунок 4. Индукция K15 при высокой плотности клеток.

N-Terts выращивали на покровных стеклах при низкой (30%) или высокой (95%) плотности клеток в RM +. Клетки фиксировали в формальдегиде и иммуноокрашивали антителами против K15 (a, b), K14 (c, d), инволюкрина (e, f) и корнифина (g, h). Все слайды были сфотографированы при одинаковом увеличении. Вставки на a и b были увеличены на i и j, соответственно, чтобы показать присутствие агрегатов K15, показанных стрелками, в кератиноцитах, выращенных при низкой плотности клеток (полоса увеличения = 20 мкм).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0038599.g004

Чтобы определить, является ли индукция K15, зависящая от плотности, уникальной для N-Tert, мы заменили N-Terts спонтанно увековеченным человеческим кератиноцитом HaCaT в эти эксперименты. Клетки HaCaT высевали при 30% или 95% конфлюэнтности и через 24 часа анализировали на экспрессию мРНК K1, K10, K14, K15, корнифина и FOXM1B. Маркеры дифференцировки K1 и K10 индуцировались в 20 и 5 раз соответственно, тогда как корнифин увеличивался только в 2 раза.Экспрессия FOXM1B не влияла, но K14 индуцировалась в 2 раза (фиг. S2a). Экспрессия белка увеличивалась для K14, но незначительно для K15 (фиг. S2b).

Роль PKC в индукции экспрессии K15

Сообщалось, что воздействие на кератиноциты PMA активирует PKC и вызывает дифференцировку [46]. Чтобы выяснить, активирует ли индуцированная PMA дифференцировка K15, мы обрабатывали N-Terts различными концентрациями (0–500 нМ) PMA и наблюдали индукцию корнифина и инволюкрина, тогда как K1, K10 и FOXM1B подавлялись.На экспрессию K14 это не повлияло, тогда как K15 индуцировался примерно в 10 раз при 10 нМ PMA (фиг. 5a). Эти данные были подтверждены вестерн-блоттингом, при котором K15 индуцировался PMA, K14 не влиял, а инволюкрин индуцировался лишь незначительно (фиг. 5b). Иммуноокрашивание N-Terts, обработанных 10 нМ PMA, показало усиленную экспрессию K15, инволюкрина и корнифина, тогда как экспрессия K14 была лишь незначительно снижена (фиг. 5e-l).

Рисунок 5. Влияние активатора и ингибитора PKC на экспрессию K15 в кератиноцитах.

(a) N-Терты в RM + подвергались воздействию различных концентраций PMA (0–500 нМ) или ДМСО в течение 24 часов, а экспрессия мРНК определялась с помощью кПЦР. (b) Кератиноциты подвергали воздействию 0 или 10 нМ PMA в течение ночи и определяли уровни белка с помощью вестерн-блоттинга. (c) N-Terts, выращенные в SFM, суспендировали в 1,3% (мас. / об.) метилцеллюлозе без добавки, 0,02% DMSO или 5 мкМ ингибитора PKC GF109203X в течение 24 часов, и клетки использовали для определения экспрессии мРНК. Свежеприготовленную трипсинизированную суспензию одиночных клеток N-Terts использовали в качестве контрольных клеток 0 ч.(d) N-Tert кератиноциты суспендировали, как в (c), с GF109203X, и экспрессию белка через 0 или 24 часа определяли вестерн-блоттингом. Каждая полоса представляет собой среднее значение ± SEM, где n = 3. (P <0,01, очень значимо, **; P <0,001, чрезвычайно значимо, ***). Для иммуноокрашивания N-Terts, растущие на покровных стеклах в RM +, обрабатывали 10 нМ PMA (f, h, j, l) или DMSO control (e, g, i, k) в течение 24 часов. Клетки фиксировали в 3,8% формальдегиде и иммуноокрашивали антителами против K15 (e, f), K14 (g, h), инволюкрина (i, j) и корнифина (k, l) (полоса увеличения = 20 мкм).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0038599.g005

Чтобы показать, что индуцированная суспензией экспрессия K15 также включает активацию PKC, мы суспендировали N-Terts в метилцеллюлозе в присутствии высокоспецифичного ингибитора PKC GF109203X [ 47]. Как показано на рисунке 5c, 5 мкМ GF109203X увеличивали экспрессию K14 и FOXM1B, тогда как инволюкрин и K15 были в значительной степени подавлены. Экспрессия белка K15 также подавлялась GF109203X, но не влиял на K14 (рис.5d), что свидетельствует о высокой селективности ингибитора в отношении K15. Эти наблюдения показали, что механизмы, регулирующие гены K14 и K15, различны.

Knocking Down PKCδ, но не PKCη подавляет индуцированную суспензией экспрессию K15

Эпидермальные кератиноциты экспрессируют пять различных изоформ PKC [48]. Чтобы определить, какая изоформа PKC участвует в индуцированной суспензией экспрессии K15, мы сначала идентифицировали изоформы PKC, которые транскрибировались после суспендирования N-Terts в метилцеллюлозе.Только транскрипции PKCδ и PKCη индуцировались более чем в 2 раза, а остальные не изменились (рис. S3).

Используя siRNA, мы независимо подавили PKCδ или PKCη, чтобы определить их влияние на экспрессию K15, индуцированную суспензией. Мы обнаружили, что подавление PKCδ примерно до 80% снижает транскрипцию K15 примерно на 50%, тогда как подавление PKCη было неэффективным (рис. 6).

Рис. 6. Нокаут PKC подавляет экспрессию K15, индуцированную суспензией.

N-Terts трансфицировали отдельно ложной (без олиго), контрольной миРНК или миРНК для PKCδ или PKCη.Через 48 часов трансфекции клетки суспендировали в метилцеллюлозе в течение 24 часов и использовали для определения экспрессии мРНК K15, PKCδ и PKCη с помощью кПЦР. Каждая полоса представляет собой среднее значение ± SEM, где n = 3. (P <0,05, значимое, *; P <0,01, очень значительное, **).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0038599.g006

Роль AP-1 в индуцированной суспензией экспрессии K15

Один из механизмов терминальной дифференцировки кератиноцитов включает путь киназы MAP, который приводит к индукции AP-1, фактора транскрипции, который является комплексом членов семейств белков Jun и Fos [49].Чтобы выяснить, требуется ли активация AP-1 для транскрипции K15 в суспензионной культуре, N-Terts обрабатывали различными концентрациями высокоспецифичного ингибитора AP-1 SR11302 [50] с последующей суспензией метилцеллюлозы. Когда концентрация ингибитора увеличивалась с 0 до 2 мкМ, транскрипция K15 снижалась примерно на 75%, не влияя на K14. Дальнейшее увеличение ингибитора с 2–5 мкМ не изменяло K15, но экспрессия K14 увеличивалась (рис. 7b). Эти эксперименты дополнительно подчеркивают различия в регуляторных механизмах K14 и K15, хотя оба являются базально-специфическими генами кератина типа I.

Фиг. 7. Роль AP-1 в индуцированной суспензией экспрессии K15.

(a) Индукция K15, но подавление K14 после 24-часовой суспензии N-Terts в метилцеллюлозе. (b) N-Terts обрабатывали различными концентрациями SR11302 или DMSO перед суспендированием в метилцеллюлозе. Через 24 часа клетки использовали для определения экспрессии мРНК K14 и K15. (c) Клетки HaCaT трансдуцировали ретровирусами, экспрессирующими TAM67, или векторным контролем pLPC. После отбора пуромицина клетки суспендировали в метилцеллюлозе в течение 24 часов и использовали для анализа экспрессии генов с помощью кПЦР.Каждая полоса представляет собой среднее значение ± SEM, где n = 3. (P <0,01, очень значимо, **; P <0,001, чрезвычайно значимо, ***).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0038599.g007

Чтобы дополнительно продемонстрировать роль AP-1 в экспрессии K15, клетки HaCaT трансдуцировали ретровирусом, экспрессирующим TAM67, доминантно-отрицательную форму c-Jun. , или вектор pLPC. Экспрессия TAM67 значительно ингибировала индуцированную суспензией дифференцировку HaCaT, о чем свидетельствует снижение экспрессии корнифина по сравнению с векторным контролем (фиг.7в). Экспрессия K15 следовала той же тенденции, что и корнифин, но K14 и FOXM1B незначительно влияли (фиг. 7c). Это дополняет данные, показанные на рисунке 7b, с использованием ингибитора AP-1 SR11302.

Роль FOXM1B в экспрессии K15

Недавно мы показали, что эктопическая экспрессия FOXM1B в нормальных кератиноцитах дозозависимо индуцирует транскрипцию гена K15 [44]. Чтобы выяснить, связывается ли FOXM1B с промотором K15, мы выполнили иммунопреципитацию Х-хроматина (X-ChIP) с использованием высокоспецифичного антитела FOXM1B.Иммунопреципитированные фрагменты промотора K15 количественно оценивали с помощью кПЦР с использованием праймеров, специфичных для семи различных областей промотора (фиг. 8а; таблица S1). Как показано на фигуре 8 (b, c), единственный фрагмент из области от -2500 до –2000 иммунопреципитировал до 38-кратного превышения по сравнению с окружающими фрагментами. Тщательный поиск промотора K15 идентифицировал единственный мотив (-2177-2155) в этом фрагменте, который имел 75% идентичность последовательности с опубликованным мотивом связывания для FOXM1B [51] (рис. 8a).

Рисунок 8. Сайт связывания FOXM1B на промоторе K15.

(a) Промотор K15, разделенный на семь фрагментов (F1 – F7) с уникальным мотивом связывания FOXM1B (K15), и его сравнение с консенсусной последовательностью (con), а нуклеотиды, выделенные красным цветом, подчеркивают различия. (b) Иммунопреципитация Х-хроматина (X-ChIP): первичные кератиноциты человека, трансдуцированные химерой FOXM1B-GFP, подвергали X-ChIP с использованием антител FOXM1B и GAPDH (в качестве контроля). Иммунопреципитированная ДНК была количественно определена с помощью кПЦР с использованием праймеров, специфичных для различных областей (F1 – F7) (см. Панель а).Все праймеры продуцировали один продукт (пик плавления), и показан график до (общий ввод) и после добавления антител к FOXM1B (FOX) и GAPDH (GAP) (фракция IP). Для ясности показаны данные только для 3 наборов праймеров. (c) Фрагменты ДНК, иммунопреципитированные антителом FOXM1B, определяли количественно с помощью qPCR. Каждая полоса представляет собой среднее значение ± SEM, где n = 3.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0038599.g008

Обсуждение

Это первое исследование, показывающее, что K15 индуцируется, когда кератиноциты дифференцируются путем лишения якоря в метилцеллюлозе, или при высокой плотности клеток, или с помощью PMA.Это было неожиданно, потому что экспрессия K15 in vivo ограничена базальным слоем; в эпидермисе экспрессия в основном ограничена ребрами rete, тогда как в оральном и других внутренних эпителиях она непрерывна в базальном слое [21], [52]. Однако в некоторых стратифицированных эпителиях, таких как пищевод, K15 обычно экспрессируется в базальном и супрабазальном слоях [18], [22], [39]. Кроме того, K15 экспрессируется в надбазальных слоях пузырей вируса ветряной оспы (VZV) (Manu Singh, неопубликованные данные) и в красном плоском лишае полости рта [40].Более того, воздействие гормона щитовидной железы или гамма-интерферона на свежеразрезанные участки кожи, по-видимому, индуцирует экспрессию K15 в надбазальных слоях [42]. Это, возможно, указывает на то, что механизм дифференцировочно-специфической экспрессии K15 существует в многослойном эпителии, который может запускаться стрессом. Однако причина, по которой K15 не экспрессируется в супрабазальных слоях эпидермиса и орального эпителия, неясна. Возможно, что до сих пор неустановленный механизм ограничивает экспрессию K15 базальным слоем.

Из всех методов, использованных в этом исследовании, только суспензионная культура метилцеллюлозы приводит к необратимой потере пролиферации с образованием корнеоцитов (мертвых клеток), процесс, напоминающий терминальную дифференцировку в коже [8], [43], [53] ]. Профиль экспрессии гена в суспензионной культуре действительно показывает зависимость от условий культивирования, например, двухфазный характер профиля в RM + (рис. S1). Это может быть связано с высокой концентрацией EGF в RM +, который, как было показано, де-дифференцирует кератиноциты, а также подавляет экспрессию K15 [22], [36].При использовании других методов дифференцировки кератиноцитов, использованных в этом исследовании — высокой концентрации внеклеточного кальция, высокой плотности клеток и лечения ФМА — дифференцировка либо неполная, либо может быть обращена вспять с небольшой потерей пролиферации. Эти различия отражались в профилях экспрессии генов, например, гены, специфичные для дифференцировки, K1, K10, корнифин и инволюкрин, были индуцированы в суспензионной культуре, тогда как K14, базальный клеточно-специфический (или специфичный для пролиферации) маркер был подавлен (рис.1а). Когда кератиноциты дифференцировались при высокой плотности клеток, мРНК K14 неожиданно увеличивалась с увеличением плотности клеток (рис. 3). Хотя основание для этого наблюдения не было ясным, ранее сообщалось др. [54], что передача сигналов, генерируемая высокой плотностью клеток, имела индуктивный эффект на K14, подобный эффекту на гены, специфичные для дифференцировки. Точно так же уровни мРНК и белка K15 не увеличивались пропорционально, когда кератиноциты дифференцировались либо с помощью PMA, либо в суспензионной культуре.Например, в суспензионной культуре уровни мРНК маркеров дифференцировки (включая K15) увеличились более чем в 100 раз, тогда как увеличение уровня белка было только в 2–3 раза (сравните рис. 1а-1в). Это может быть связано с тем, что либо мРНК, синтезируемая во время дифференцировки, не транслируется в белок, либо белок синтезируется, но поскольку соотношение полипептидов типа I и типа II превышает 1-1, они не могут собираться в филаменты. Любые несобранные кератины очень нестабильны и удаляются протеолизом.Однако, когда кератиноциты обрабатывали PMA, уровень мРНК K15 индуцировался в 10 раз, но белок синтезировался на гораздо более высоком уровне, чем в суспензионной культуре (сравните фиг. 1c с фиг. 5b). Более того, два специфичных для дифференцировки маркера K1 и K10 фактически уменьшаются под действием PMA (Fig. 5a), что согласуется с тем, что было описано ранее для этих генов [55], [56]. Хотя молекулярная основа этого наблюдения не ясна, возможно, что PMA активирует определенные изоформы PKC, которые подавляют эти гены, или PMA запускает другой механизм с репрессивными эффектами на транскрипцию K1 и K10.

Сравнение экспрессии K14 с K15 в суспензионной культуре предполагает, что, хотя два гена экспрессируются в базальном слое, K14 супрессируется, тогда как K15 индуцируется в начале терминальной дифференцировки (Fig. 1a). Это первое сообщение, в котором показано, что подавление β1-интегрина индуцирует транскрипцию K15 в суспензионной культуре. Можно утверждать, что индукция K15 была связана с остановкой клеточного цикла, а не с дифференцировкой кератиноцитов. Однако известно, что присутствие фибронектина в суспензионной культуре подавляет дифференцировку, не предотвращая остановки клеточного цикла [43].В этом исследовании мы обнаружили, что фибронектин и пептид RGD подавляли экспрессию K15, предполагая, что индукция K15 в метилцеллюлозе была вызвана дифференцировкой кератиноцитов, а не остановкой клеточного цикла. Есть несколько сообщений, которые предполагают, что K15 был маркером эпидермальных стволовых клеток [23], [24], [25], [26], [27], [28], [29]. Хотя расположение стволовых клеток в эпидермисе не известно; в некоторых сообщениях говорится, что они находятся на вершине гребешков [52], в то время как другие указывают на их расположение в пределах дермальных сосочков [57], [58], в то время как недавние исследования предполагают, что они могут находиться где угодно в базальном слое [59] .Однако можно сказать наверняка, что они дают начало ТА-клеткам, которые перемещаются латерально от зоны стволовых клеток, чтобы заселить базальный слой. Портер и соавторы предположили, что K15 не является маркером стволовых клеток, а является маркером латерально дифференцированных кератиноцитов [22]. Однако латеральная дифференцировка не требует подавления β1-интегрина, который обычно экспрессируется во всем базальном слое [60], [61], [62]. Именно вертикальная / терминальная дифференцировка запускается подавлением β1-интегрина [8].Наше наблюдение, что в суспензии β1-интегрины подавляются и индуцируется транскрипция K15, предполагает, что K15 также может быть маркером кератиноцитов, подвергающихся вертикальной / терминальной дифференцировке при определенных условиях.

Обработка кератиноцитов PMA индуцирует дифференцировку и экспрессию K15 (Fig. 5a), что согласуется с недавним сообщением о том, что PMA-индуцированное повреждение эпидермиса увеличивает супрабазальную экспрессию K15 [33]. Кроме того, было показано, что обработка кератиноцитов дифференцирующим агентом 2- (3,4,5-триметоксифениламино) -пирроло [2,3-d] пиримидин индуцирует транскрипцию K15 [63].Участие PKC в индукции транскрипции K15 было продемонстрировано при использовании PMA и ингибитора PKC (рис. 5). Среди изоформ PKC, которые экспрессируются в кератиноцитах, PKCδ, PKCη и PKCε участвуют в дифференцировке [64], [65], [66]. Однако более поздние исследования с использованием siRNA показали, что участвуют только PKCδ и PKCη [67]. В недавнем исследовании две изоформы обратным образом влияли на экспрессию лорикрина, маркера дифференцировки, ингибируемого PKC, тогда как PKC η индуцировал лорикрин в дифференцировке кератиноцитов [68].В этом исследовании мы обнаружили, что подавление PKCδ на 80% подавляет транскрипцию K15 примерно на 50%, тогда как подавление PKCη было неэффективным (рис. 6). На первый взгляд данные о нокдауне siRNA могут показаться несовместимыми с ингибитором PKC GF109203X (фиг. 5), который был очень мощным в ингибировании транскрипции K15, но эти два метода нельзя сравнивать. Ингибитор PKC будет подавлять активность фермента и, следовательно, всегда будет более сильным, тогда как siRNA будет снижать уровень белка PKC, разрушая его мРНК.Альтернативно, возможно, что высокая активность GF109203X была обусловлена ​​ингибированием других изоформ PKC в дополнение к PKC. Известно, что активация PKC индуцирует AP-1 в кератиноцитах (обзор см. В [69]), что согласуется с нашим наблюдением, что ингибирование AP-1 либо SR11302, либо доминантно негативным c-Jun подавляет индуцированное суспензией K15, что также согласуется с идентификацией связывающего AP-1 мотива в промоторе K15 [42]. Интересным наблюдением было подавление транскрипции K14 в суспензионной культуре (рис.1, 5). С одной стороны, подавление синтеза K14 в дифференцирующихся кератиноцитах согласуется с тем, что происходит in vivo , но несовместимо с сообщениями в литературе о том, что промотор K14 индуцируется AP-1 [70]. Если суспензионная культура индуцирует AP-1, как показывают наши данные (рис. 7), то такая обработка также должна увеличивать экспрессию K14. Однако можно предположить, что мотив AP-1 в промоторе K14, хотя и способен биохимически отвечать на AP-1 [70], не играет функциональной роли в экспрессии K14, или его эффект перекрывается другой дедифференцировкой. -специфический механизм в базальном слое.

Об индукции экспрессии белка K15 при высокой клеточной плотности сообщалось ранее [22], [41], однако роль транскрипционных, посттранскрипционных и посттрансляционных механизмов в индукции K15 не известна [71], [72] ], [73]. Это первое исследование, в котором высокая плотность кератиноцитов была связана с повышенной транскрипцией гена K15. Мы также впервые показываем, что K15, синтезированный при низкой клеточной плотности, существует в виде глобул, тогда как при высокой клеточной плотности преимущественно видна нитевидная форма.Неспособность глобулярного K15 интегрироваться в уже существующие K5 / K14 филаменты при низкой плотности клеток может быть либо из-за его низкой концентрации, либо из-за химической модификации, такой как фосфорилирование. Принимая во внимание, что, с одной стороны, дифференцировка кератиноцитов, индуцированная высокой плотностью клеток, как сообщается, опосредуется активацией PKC / AP-1, что объясняет основу для индукции K15 при высокой клеточной плотности [74], [75], с другой стороны дифференцировка кератиноцитов, индуцированная высокий уровень внеклеточного кальция сам по себе не влиял на экспрессию K15 (данные не показаны), как сообщалось другими [22].Это интересно, потому что дифференцировка кератиноцитов, индуцированная высоким содержанием кальция, также включает путь PKC / AP-1 [76], так почему же кальций не индуцирует транскрипцию K15? Возможно, что высокие концентрации кальция активируют изоформу PKC, которая неспособна продуцировать правильный AP-1 (с точки зрения составляющих членов семейства Fos и Jun), способствующий индукции K15. Эта гипотеза согласуется с сообщениями о том, что активация PKC может продуцировать разные типы комплексов AP-1 с различной транскрипционной специфичностью [76], [77].

Экспрессия K15, индуцированная PKC / AP-1, не может объяснить базальную специфическую экспрессию K15, потому что большинство изоформ PKC и компонентов AP-1 не экспрессируются в базальном слое [69], [78]. Фактор транскрипции, индуцируемый sonic hedgehog, Gli1, может быть вовлечен, так как он экспрессируется в базальном слое и также индуцируется в BCC вместе с K15 [22], [32], но сверхэкспрессия Gli1 либо ретровирусом, либо нокдаун вниз patch-1, не индуцирует K15, это указывает на то, что Gli1 не регулирует напрямую K15 (Salima Mehboobali, неопубликованные наблюдения).Однако есть несколько линий доказательств, позволяющих предположить, что FOXM1B, нижестоящая мишень Gli1 [79], может регулировать экспрессию K15 в базальных кератиноцитах. Во-первых, FOXM1B и K15 коэкспрессируются в rete-гребешках [44], [52] и во внешнем корневом влагалище, включая выступ [80]. Во-вторых, K15 и FOXM1B индуцируются в BCC [22], [32], [79]. В-третьих, FOXM1B является белком, регулируемым клеточным циклом, и его активность подавляется в начале дифференцировки [81], [82]. В-четвертых, K15 (но не K14) индуцируется, когда FOXM1B сверхэкспрессируется в кератиноцитах [44].Эти отчеты согласуются с идентификацией сайта связывания FOXM1B в промоторе K15 (фиг. 8). Наши результаты предоставляют два предполагаемых механизма регуляции K15, один базальный (управляемый FOXM1), а другой супрабазальный (с участием PKC / AP-1) специфический. Эти два механизма не могут быть полностью независимыми, потому что активация PKC может подавлять FOXM1 в начале дифференцировки [82]. Это также может указывать на разные функции K15 в базальном и супрабазальном отделах. В базальном слое K15 может играть роль в передаче сигналов, пролиферации и во взаимодействиях клетка-клетка и клетка-ECM.В супрабазальных слоях K15 может быть связан с дополнительной гибкостью, необходимой в областях тела с интенсивным движением, таких как пищевод.

FOXM1B — это онкоген, который высоко экспрессируется при большинстве видов рака, который также должен индуцировать K15 в SCC [44], [81], [83], [84], [85]. Однако большинство опубликованных данных указывает на то, что K15 подавляется в SCC [32], [33]. Эти явно противоречивые наблюдения можно объяснить тем фактом, что онкогенная трансформация обычно сопровождается активацией кератиноцитов [86], что, как сообщается, несовместимо с экспрессией K15 [21], [36].Следовательно, вероятно, что индуцированная FOXM1B экспрессия K15 в SCC впоследствии подавляется активацией кератиноцитов.

В заключение, это исследование показывает, что кератиноциты, дифференцированные в метилцеллюлозе, с высокой плотностью клеток или с помощью PMA, индуцируют транскрипцию K15. Экспрессия K15, индуцированная суспензией, включает подавление β1-интегрина и может быть устранена с помощью фибронектина или пептида RGD, что позволяет предположить, что K15 может быть маркером вертикальной / терминальной дифференцировки, которая регулируется передачей сигналов PKC / AP-1.Это д. Объяснить основу экспрессии K15 в супрабазальных слоях определенных стратифицированных эпителий и в определенных клинических ситуациях. Базальная экспрессия K15 д. Использовать механизм, зависящий от пролиферации клеток, а не от дифференцировки. Мы предполагаем, что базальная клеточная / специфическая для стволовых клеток экспрессия K15 в выпуклости и других тканях может включать передачу сигналов, опосредованную FOXM1B, которая поддерживается эктопической экспрессией, иммуно-совместной локализацией и идентификацией уникального связывающего мотива FOXM1B в промоторе K15. .Тот факт, что кератиноциты, подвергающиеся терминальной дифференцировке, также могут экспрессировать K15, как показано в этом исследовании, предполагает, что следует проявлять крайнюю осторожность при интерпретации результатов, полученных при использовании K15 в качестве маркера зон стволовых клеток.

Материалы и методы

Теломераза (hTERT) и p16 иммортализованные нормальные кератиноциты кожи человека N / Tert-1 [87] и нормальные эпидермальные кератиноциты человека, полученные из крайней плоти новорожденного человека (номер по каталогу 12332-011, GIBCO Invitrogen), культивировали в сыворотке. свободная среда (SFM) с добавлением 30 мкг / мл экстракта гипофиза крупного рогатого скота и 0.2 нг / мл эпидермального фактора роста (EGF), в то время как кератиноциты HaCaT (спонтанно иммортализованная клеточная линия, полученная из кожи взрослого человека [88]) культивировали в DMEM + 10% (об. / Об.) Фетальной телячьей сыворотки (FCS) и 1 % (мас. / об.) пенициллин-стрептомицин. Метилцеллюлоза 4000 сП, форбол 12-миристат 13-ацетат, PMA (Sigma Aldrich, Дорсет, Великобритания), фибронектин плазмы человека, пептид RGD, ингибитор PKC GF109203X (Calbiochem, Ноттингем, Великобритания), ингибитор AP-1 (E, E, Z , E) -3-Метил-7- (4-метилфенил) -9- (2,6,6-триметил-1-циклогексен-1-ил) — 2,4,6,8-нонатетраеновая кислота (SR11302) ( Tocris Bioscience, Великобритания), олигонуклеотиды siRNA для PKCδ и PKCη человека (пул ON-TARGET плюс SMART ), DharmaFECT (Thermo Scientific, Лафайет, Колорадо), набор Dynabeads mRNA DIRECT (Invitrogen, Великобритания), набор для обратной транскрипции (Promega, Саутгемптон, Великобритания), агент трансфекции TransIT-LT1 (Mirus Bio LLC, Мэдисон, США), набор для анализа белка DC (Bio-Rad, Хемел Хемпстед, Великобритания).Экспрессию генов количественно оценивали с помощью абсолютной количественной ПЦР в реальном времени на Light Cycler LC480 с использованием SyBR green (Roche Diagnostics Ltd, Burgess Hill, UK). Использовались следующие антитела: кроличьи моноклональные к K15 (EPR1614Y), мышиные моноклональные к инволюкрину (SY5), мышиные моноклональные к корнифину (SPRR3), кроличьи поликлональные к GAPDH (abcam, Кембридж, Великобритания), антицитокератин 14 LLOO2 (Cancer Research UK). ), FOXM1B C-20 (Santa Cruz Biotechnology, Санта-Круз, Калифорния, США), конъюгированные с пероксидазой хрена козьи антимышиные или козьи антикроличьи (Millipore, Уотфорд, Великобритания), биотиновые козьи антимышиные и биотиновые козьи антикроличьи (Sigma Aldrich), Alexa Fluor ® 488 козлиная антимышиная и Alexa Fluor ® 488 стрептавидин (Invitrogen).Вестерн-блоттинг детектировали с использованием набора ECL для хемилюминесценции (GE Healthcare, Amersham, UK).

Индукция дифференцировки кератиноцитов суспензией в метилцеллюлозе

N-Terts (5 × 10 5 клеток) суспендировали в 1,3% (мас. / Об.) Метилцеллюлозе и высевали в 6-сантиметровые бактериологические чашки, покрытые 0,4% (мас. / Об.) Растворенного поли-2-гидроксиэтилметакрилата (polyHEMA). в смеси ацетона и 95% этанола (1∶1). После инкубации клеточной суспензии в течение необходимого периода ее разбавляли в 10 раз PBS и клетки собирали центрифугированием.Осадок лизировали либо в 500 мкл буфера для лизиса / связывания для экстракции общей мРНК, либо в 200 мкл буфера для образцов SDS для вестерн-блоттинга.

В некоторых случаях N-Terts инкубировали с добавками (фибронектин, RGD, ингибитор PKC GF109203X, ингибитор AP-1 SR11302) перед суспендированием в метилцеллюлозе. В каждом случае влияние эффектора сравнивалось с растворителем, в котором был растворен эффектор. После инкубации в течение 24 часов клетки обрабатывали для экспрессии генов с помощью кПЦР или вестерн-блоттинга.

Индукция дифференцировки кератиноцитов при высокой плотности клеток и с помощью PMA

N-Terts, культивированных в SFM, высевали при плотности 50 000 клеток в чашки для культивирования диаметром 6 см при низких (0,09 мМ) или высоких (1,8 мМ) концентрациях кальция. Клетки культивировали до достижения желаемого слияния и использовали для анализа экспрессии генов. Однако в некоторых экспериментах было помещено достаточное количество клеток для получения желаемой плотности клеток, и после роста в течение 24 часов их использовали для анализа экспрессии генов или лизировали в буфере SDS для вестерн-блоттинга.

N-Terts, культивируемых в среде RM +, помещали в чашки для культивирования диаметром 6 см и после прикрепления клетки обрабатывали PMA (0-500 нМ) в различных концентрациях, растворенных в ДМСО. Конечная концентрация ДМСО не превышала 0,04% (об. / Об.) Ни в одном из этих экспериментов. Через 24 часа клетки использовали для анализа экспрессии генов и вестерн-блоттинга.

Использование миРНК для нокдауна изоформ PKC в суспензионных культурах

N-Terts, культивируемых в SFM с плотностью около 50%, трансфицировали 10–100 нмоль миРНК с использованием реагента для трансфекции DharmaFECT, следуя инструкциям производителя.Клеткам давали возможность расти в течение 48 часов, после чего их суспендировали в метилцеллюлозе и собирали через 24 часа для анализа экспрессии генов.

Иммунофлуоресценция

Трипсинизированные кератиноциты N-Tert высевали на стерильные покровные стекла при субконфлюэнции или 90% -ном слиянии и оставляли для прикрепления в течение ночи. Клетки обрабатывали 10 нМ ФМА или ДМСО (конечная концентрация менее 0,04% об. / Об.) В течение 24 часов. Затем клетки фиксировали 3,8% -ным формальдегидом, разведенным в PBS в течение 10 мин и повышали проницаемость с помощью 0.1% (об. / Об.) Triton X-100 в PBS. Клетки блокировали 10% нормальной козьей сывороткой, разведенной в PBS + 0,2% (об. / Об.) Твин-20 (блокирующий раствор) в течение 30 минут, а затем инкубировали в течение ночи при 4 ° C с первичными антителами, разведенными в блокирующем растворе. После трехкратной промывки PBS + 0,2% (об. / Об.) Tween-20 (PBS / Tween) клетки инкубировали с биотиновыми козьими антимышиными или биотиновыми козьими антикроличьими антителами (в зависимости от природы первичного антитела). в течение 2 ч при комнатной температуре. Для K14 стадия биотина была опущена, и клетки были непосредственно обработаны меченным Alexa Fluor ® 488 козьими антимышиными антителами.Для остальных антигенов клетки трижды промывали, как и раньше, и инкубировали со стрептавидином Alexa Fluor ® 488, разведенным 1 × 100 в блокирующем растворе, в течение 1 ч при комнатной температуре. После промывки PBS / Tween покровные стекла обрабатывали 5 мкг / мл йодида пропидия в течение 1 мин, затем закрепляли с помощью Immuno-mount и просматривали в иммунофлуоресцентном микроскопе с использованием соответствующих фильтров.

Для иммуноокрашивания дифференцированных кератиноцитов N-Terts суспендировали в метилцеллюлозе в течение 24 часов и собирали разбавлением и центрифугированием, как описано выше.Осадок клеток суспендировали в 30 мкл FCS и 2–4 мкл суспензии наносили штрихами на предметные стекла (SuperFrost Plus, Thermo-Scientific) с помощью наконечника пипетки. Свежие трипсинизированные N-Terts, которые не были суспендированы в метилцеллюлозе, использовали в качестве недифференцированного 0-часового контроля. После сушки на воздухе клетки фиксировали формальдегидом и обрабатывали для иммунофлуоресценции, как описано выше.

Анализ экспрессии генов

Набор

Dynabeads mRNA DIRECT использовали для экстракции общей мРНК и сразу же преобразовали в кДНК путем обратной транскрипции с использованием смеси олиго-dT и случайных гексамеров, следуя инструкциям производителя.Абсолютная кПЦР в реальном времени выполнялась для каждого гена, как описано ранее [84]. Два внутренних эталонных гена (YAP1 и POLR2A) использовали для нормализации целевого гена. Последовательности праймеров кПЦР для K1, K10, K14, K15, инволюкрина, FOXM1B и корнифина были описаны ранее [44], а последовательности для β1-интегрина, изоформ PKC и фрагментов промотора K15 перечислены в таблице S1. КДНК TAM67 амплифицировали с помощью ПЦР и субклонировали в сайтах Eco RI / Bam HI вектора pLPC_cmyc (Addgene, Кембридж, США), и конструкцию подтверждали секвенированием.Для создания супернатанта амфотропного ретровируса с дефицитом репликации клетки Phoenix A трансфицировали конструкцией pLPC_cmyc-TAM67 с использованием TransIT-LT1 в соответствии с инструкциями производителя. После 72 ч трансфекции клетки отбирали в пуромицине 2,5 мкг / мл до тех пор, пока не стали видны устойчивые к лекарственным средствам колонии. Отбор продолжали до слияния клеток. Супернатанты ретровирусов собирали из конфлюэнтных культур в отсутствие пуромицина и хранили при -80 ° C для будущего использования.Трансдукцию кератиноцитов с использованием супернатанта рекомбинантного ретровируса проводили с использованием 5 мкг / мл гексадиметринбромида (полибрена), как описано ранее [84]. Трансдуцированные клетки отбирали в 2,5 мкг / мл пуромицина до получения стабильной культуры.

Другие методы

Концентрацию белка определяли с помощью набора для анализа белков Bio-Rad DC. Подсчет клеток производился с помощью гемоцитометра. Электрофорез в SDS проводили на 4–12% градиентных гелях (Invitrogen) в буфере Bis-Tris.Для вестерн-блоттинга белки переносили электрофоретически на нитроцеллюлозные мембраны. После зондирования антителами 1 st и 2 st мембраны проявляли с использованием системы детекции Amersham ECL Western Blotting.

Статистический анализ

t-критерии Стьюдента были выполнены с использованием Microsoft Excel, и все результаты представлены как среднее значение 3 отдельных экспериментов со стандартной ошибкой среднего (S.E.M). Рассчитывалось значение P, которое считалось значимым, если было ниже 0.05.

Дополнительная информация

Рисунок S1.

Дифференциация первичных кератиноцитов человека в суспензии. (a) N-Terts и (b) нормальные первичные эпидермальные кератиноциты человека, растущие в RM + + 10% FCS, суспендировали в DMEM + 20% FCS, содержащей 1,3% (мас. / Об.) Метилцеллюлозы. В разные промежутки времени клетки собирали и использовали для определения экспрессии мРНК с помощью кПЦР. Среда RM + содержит 10 нг / мл EGF по сравнению с 0,2 нг / мл в SFM.Начальная фаза де-дифференциации на графике может быть связана с большим избытком EGF в RM + . Каждая полоса представляет собой среднее значение ± SEM, где n = 3.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0038599.s001

(TIF)

Рисунок S2.

Индукция транскрипции K15 в HaCaT при высокой плотности клеток. (a) Кератиноциты HaCaT выращивали при низкой (30%) и высокой (95%) конфлюэнтности при низкой концентрации кальция (0,09 мМ) в течение 24 часов, после чего клетки лизировали для определения экспрессии мРНК.(b) Клетки, выращенные при низкой (S) и высокой (C) плотностях, анализировали вестерн-блоттингом на экспрессию K14, K15 и инволюкрина. Каждая полоса представляет собой среднее значение ± SEM, где n = 3. (P <0,01, очень значимо, **; P <0,001, чрезвычайно значимо, ***).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0038599.s002

(TIF)

Рисунок S3.

Индукция транскрипции PKCδ и PKCη в суспензионной культуре. N-Terts, выращенных в SFM, суспендировали в DMEM + 10% FCS, содержащей 1.3% (мас. / Об.) Метилцеллюлозы. Через 24 часа клетки собирали для определения уровней мРНК PKCα, PKCδ, PKCη, PKCζ и PKCε с помощью кПЦР. Каждая полоса представляет собой среднее значение ± SEM, где n = 3. (P <0,01, очень значимо, **; P <0,001, чрезвычайно значимо, ***).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0038599.s003

(TIF)

Благодарности

Авторы хотели бы поблагодарить Ian MacKenzie за полезные обсуждения роли кератинов в эпидермальных стволовых клетках и Tomasz Kordula за предоставленную нам конструкцию кДНК TAM67 для этого исследования.Мы также благодарим Салиму Мехбоубали за ее помощь в экспериментах над сверхэкспрессирующими кератиноцитами Gli1.

Вклад авторов

Задумал и спроектировал эксперименты: AW MTT. Проведены эксперименты: AB AW MTT HW. Проанализированы данные: AB MTT. Предоставленные реагенты / материалы / инструменты анализа: ILH IML. Написал бумагу: AW.

Список литературы

  1. 1. Barrandon Y, Green H (1987) Три клональных типа кератиноцитов с разной способностью к размножению.Proc Natl Acad Sci U S A 84: 2302–2306.
  2. 2. Cotsarelis G, Sun TT, Lavker RM (1990) Клетки, сохраняющие метку, находятся в области выпуклости волосяного покрова: последствия для фолликулярных стволовых клеток, цикла волос и канцерогенеза кожи. Ячейка 61: 1329–1337.
  3. 3. Jones PH, Watt FM (1993) Отделение эпидермальных стволовых клеток человека от транзитных амплифицирующих клеток на основе различий в функции и экспрессии интегрина. Ячейка 73: 713–724.
  4. 4.Моррис Р.Дж., Поттен С.С. (1994) Медленно повторяющиеся (сохраняющие метку) эпидермальные клетки ведут себя как клоногенные стволовые клетки in vitro. Cell Prolif 27: 279–289.
  5. 5. Rochat A, Kobayashi K, Barrandon Y (1994) Расположение стволовых клеток волосяных фолликулов человека с помощью клонального анализа. Cell 76: 1063–1073.
  6. 6. Taylor G, Lehrer MS, Jensen PJ, Sun TT, Lavker RM (2000) Участие фолликулярных стволовых клеток в формировании не только фолликула, но и эпидермиса. Ячейка 102: 451–461.
  7. 7. Джейн С. М., Лоуэлл С., Хаттер С. (2002) Эпидермальные стволовые клетки. Дж. Патол 197: 479–491.
  8. 8. Adams JC, Watt FM (1990) Изменения в адгезии кератиноцитов во время терминальной дифференцировки: снижение связывания фибронектина предшествует потере интегрина альфа 5 бета 1 с поверхности клетки. Ячейка 63: 425–435.
  9. 9. Hesse M, Magin TM, Weber K (2001) Гены для белков промежуточных филаментов и предварительная последовательность генома человека: новые гены кератина и удивительно большое количество псевдогенов, связанных с генами кератина 8 и 18.J Cell Sci 114: 2569–2575.
  10. 10. Schweizer J, Bowden PE, Coulombe PA, Langbein L, Lane EB, et al. (2006) Новая согласованная номенклатура кератинов млекопитающих. J Cell Biol 174: 169–174.
  11. 11. Moll R, Franke WW, Schiller DL, Geiger B, Krepler R (1982) Каталог цитокератинов человека: паттерны экспрессии в нормальном эпителии, опухолях и культивируемых клетках. Ячейка 31: 11–24.
  12. 12. Кирфель Дж., Магин TM, Райхельт Дж. (2003) Кератины: структурный каркас с новыми функциями.Cell Mol Life Sci 60: 56–71.
  13. 13. Bloor BK, Su L, Shirlaw PJ, Morgan PR (1998) Экспрессия генов дифференцировочно-специфичных кератинов (4/13 и 1/10) в нормальной слизистой оболочке щеки человека. Lab Invest 78: 787–795.
  14. 14. Свенссон О., Лангбейн Л., Макмиллан Дж. Р., Стивенс Х. П., Ли И. М. и др. (1998) Специализированный паттерн экспрессии кератина в ребристой коже человека как адаптация к высоким физическим нагрузкам. Брит Дж. Дерматол 139: 767–775.
  15. 15. Machesney M, Tidman N, Waseem A, Kirby L, Leigh I (1998) Активированные кератиноциты в эпидермисе гипертрофических рубцов.Am J Pathol 152: 1133–1141.
  16. 16. Блур Б.К., Тидман Н., Ли И.М., Оделл Э., Доган Б. и др. (2003) Экспрессия кератина K2e в кожных и оральных поражениях: связь с активацией, пролиферацией и ороговением кератиноцитов. Am J Pathol 162: 963–975.
  17. 17. Fuchs E, Green H (1980) Изменения в экспрессии гена кератина во время терминальной дифференцировки кератиноцитов. Cell 19: 1033–1042.
  18. 18. Ллойд С., Ю. К. К., Ченг Дж., Тюрксен К., Дегенштейн Л. и др.(1995) Базальная кератиновая сеть многослойного плоского эпителия: определение функции K15 в отсутствие K14. J Cell Biol 129: 1329–1344.
  19. 19. Молл Р., Леви Р., Чернобильский Б., Хольвег-Майерт П., Далленбах-Хелльвег Г. и др. (1983) Цитокератины нормального эпителия и некоторых новообразований женских половых путей. Lab Invest 49: 599–610.
  20. 20. Jonkman MF, Heeres K, Pas HH, van Luyn MJ, Elema JD и др. (1996) Влияние абляции кератина 14 на клинический и клеточный фенотип в родстве с рецессивным буллезным эпидермолизом.J Invest Dermatol 107: 764–769.
  21. 21. Васим А., Доган Б., Тидман Н., Алам Ю., Пуркис П. и др. (1999) Экспрессия кератина 15 в многослойном эпителии: подавление в активированных кератиноцитах. J Invest Dermatol 112: 362–369.
  22. 22. Портер Р.М., Ланни Д.П., Огден П.Х., Морли С.М., Маклин WH и др. (2000) Экспрессия K15 подразумевает латеральную дифференцировку в многослойных базальных клетках эпителия. Lab Invest 80: 1701–1710.
  23. 23. Lyle S, Christofidou-Solomidou M, Liu Y, Elder DE, Albelda S и др.(1998) Моноклональное антитело C8 / 144B распознает цитокератин 15 и определяет местоположение стволовых клеток волосяного фолликула человека. J Cell Sci 111 (Pt 21): 3179–3188.
  24. 24. Жан К., Синьоретти С., Уитакер-Менезес Д., Фридман Т.М., Корнгольд Р. и др. (2007) Cytokeratin15-позитивные базальные эпителиальные клетки, нацеленные на реакцию «трансплантат против хозяина», экспрессируют конститутивный антиапоптотический фенотип. J Invest Dermatol 127: 106–115.
  25. 25. Охьяма М., Терунума А., Ток К.Л., Радонович М.Ф., Пизе-Масисон С.А. и др.(2006) Характеристика и выделение обогащенных стволовыми клетками клеток выпуклости волосяного фолликула человека. Дж. Клин Инвест 116: 249–260.
  26. 26. Йошида С., Шиммура С., Кавакита Т., Мияшита Х., Дэн С. и др. (2006) Цитокератин 15 можно использовать для идентификации лимбального фенотипа нормальной и пораженной глазных поверхностей. Инвестируйте в офтальмол Vis Sci 47: 4780–4786.
  27. 27. Liu Y, Lyle S, Yang Z, Cotsarelis G (2003) Промотор Keratin 15 нацелен на предполагаемые эпителиальные стволовые клетки в выпуклости волосяного фолликула.J Invest Dermatol 121: 963–968.
  28. 28. Моррис Р.Дж., Лю Й., Марлес Л., Ян З., Тремпус С. и др. (2004) Захват и профилирование стволовых клеток взрослых волосяных фолликулов. Nat Biotechnol 22: 411–417.
  29. 29. Якс В., Баркер Н., Каспер М., ван Эс Дж. Х., Снапперт Г. Дж. И др. (2008) Lgr5 отмечает циклические, но долгоживущие стволовые клетки волосяных фолликулов. Нат Генет 40: 1291–1299.
  30. 30. Whitbread LA, Powell BC (1998) Экспрессия гена кератина промежуточного филамента, K15, в слоях базальных клеток эпителия и волосяного фолликула.Exp Cell Res 244: 448–459.
  31. 31. Баркер Н., ван Эс Дж. Х., Якс В., Каспер М., Снипперт Н. и др. (2008) Очень долгосрочное самообновление тонкой кишки, толстой кишки и волосяных фолликулов с помощью циклических стволовых клеток Lgr5 + ve. Колд-Спринг-Харб Symp Quant Biol 73: 351–356.
  32. 32. Jih DM, Lyle S, Elenitsas R, Elder DE, Cotsarelis G (1999) Экспрессия цитокератина 15 в трихоэпителиомах и подмножестве базальноклеточных карцином предполагает, что они происходят из стволовых клеток волосяного фолликула.Дж. Кутан Патол 26: 113–118.
  33. 33. Troy TC, Arabzadeh A, Turksen K (2011) Переоценка K15 как маркера эпидермальных стволовых клеток. Стволовые клетки Ред. 7: 1041–1045.
  34. 34. Сакамото К., Арагаки Т., Морита К., Кавачи Х., Каямори К. и др. (2011) Подавление экспрессии кератина 4 и кератина 13 при плоскоклеточном раке полости рта и эпителиальной дисплазии: ключ к гистопатогенезу. Гистопатология 58: 531–542.
  35. 35. Аль-Рефу К., Эдвард С., Ингам Э., Гудфилд М. (2009) Экспрессия стволовых клеток волосяного фолликула, обнаруженная с помощью окрашивания цитокератином 15: последствия для патогенеза процесса рубцевания при кожной красной волчанке.Брит Дж. Дерматол 160: 1188–1196.
  36. 36. Werner S, Munz B (2000) Подавление экспрессии кератина 15 путем трансформации фактора роста бета in vitro и путем повреждения кожи in vivo. Exp Cell Res 254: 80–90.
  37. 37. Sperling LC, Hussey S, Wang JA, Darling T (2011) Экспрессия цитокератина 15 при центральной, центробежной, рубцовой алопеции: новые наблюдения в нормальных и больных волосяных фолликулах. J Cut Pathol 38: 407–414.
  38. 38. Понтиджиа Л., Бидерманн Т., Меули М., Видмер Д., Ботчер-Хаберзет С. и др.(2009) Маркеры для оценки качества и способности к самообновлению искусственных заменителей кожи человека in vitro и после трансплантации. Дж. Инвест дерматол 129: 480–490.
  39. 39. Leube RE, Bader BL, Bosch FX, Zimbelmann R, Achtstaetter T и др. (1988) Молекулярная характеристика и экспрессия цитокератинов 4 и 15, связанных со стратификацией. J Cell Biol 106: 1249–1261.
  40. 40. Bloor BK, Seddon SV, Morgan PR (2000) Экспрессия генов дифференцировочно-специфичных кератинов (K4, K13, K1 и K10) при недиспластических кератозах полости рта и красном плоском лишае.J Oral Pathol & Med 29: 376–384.
  41. 41. Ryle CM, Breitkreutz D, Stark HJ, Leigh IM, Steinert PM и др. (1989) Зависимая от плотности модуляция синтеза кератинов 1 и 10 в линии кератиноцитов человека HACAT и в трансфицированных ras онкогенных клонах. Дифференциация 40: 42–54.
  42. 42. Радоя Н., Стоядинович О., Васим А., Томич-Канич М., Милисавлевич В. и др. (2004) Гормоны щитовидной железы и гамма-интерферон специфически увеличивают транскрипцию гена кератина K15.Mol Cell Biol 24: 3168–3179.
  43. 43. Adams JC, Watt FM (1989) Фибронектин ингибирует терминальную дифференцировку кератиноцитов человека. Nature 340: 307–309.
  44. 44. Gemenetzidis E, Elena-Costea D, Parkinson EK, Waseem A, Wan H, et al. (2010) Индукция экспансии эпителиального ствола / предшественника человека с помощью FOXM1. Cancer Res 70: 9515–9526.
  45. 45. Lash JW, Linask KK, Yamada KM (1987) Синтетические пептиды, которые имитируют адгезивный сигнал распознавания фибронектина: дифференциальные эффекты на адгезию клетка-клетка и клетка-субстрат в эмбриональных клетках цыплят.Дев Биол 123: 411–420.
  46. 46. Matsui MS, Illarda I, Wang N, DeLeo VA (1993) Эффекты агониста и антагониста протеинкиназы C в нормальных эпидермальных кератиноцитах человека. Exp Dermatol 2: 247–256.
  47. 47. Робертс Н.А., Марбер М.С., Авкиран М. (2004) Специфичность действия ингибиторов бисиндолилмалеимидной протеинкиназы С: ингибируют ли они 70 кДа рибосомальную киназу S6 в сердечных миоцитах? Biochem Pharmacol 68: 1923–1928.
  48. 48. Dlugosz AA, Mischak H, Mushinski JF, Yuspa SH (1992) Транскрипты, кодирующие протеинкиназу C-alpha, -delta, -epsilon, -zeta и -eta, экспрессируются в базальных и дифференцирующихся кератиноцитах мыши in vitro и демонстрируют количественные изменения в опухолевых клетках. клетки.Mol Carcinogen 5: 286–292.
  49. 49. Halazonetis TD, Georgopoulos K, Greenberg ME, Leder P (1988) c-Jun димеризуется сам с собой и с c-Fos, образуя комплексы с различной аффинностью связывания ДНК. Ячейка 55: 917–924.
  50. 50. Fanjul A, Dawson MI, Hobbs PD, Jong L, Cameron JF и др. (1994) Новый класс ретиноидов с селективным ингибированием AP-1 подавляет пролиферацию. Природа 372: 107–111.
  51. 51. Йе Х., Келли Т.Ф., Самадани Ю., Лим Л., Рубио С. и др.(1997) Ядерный фактор гепатоцитов 3 / гомолог 11 головки вилки экспрессируется в пролиферирующих эпителиальных и мезенхимальных клетках эмбриональных и взрослых тканей. Mol Cell Biol 17: 1626–1641.
  52. 52. Уэбб А., Ли А., Каур П. (2004) Расположение и фенотип кератиноцитарных стволовых клеток кожи взрослого человека. Дифференциация 72: 387–395.
  53. 53. Green H (1977) Терминальная дифференцировка культивируемых эпидермальных клеток человека. Ячейка 11: 405–416.
  54. 54. Poumay Y, Pittelkow MR (1995) Факторы плотности клеток и культуры регулируют приверженность кератиноцитов дифференцировке и экспрессии супрабазальных кератинов K1 / K10.J Invest Dermatol 104: 271–276.
  55. 55. Poumay Y, Herphelin F, Smits P, De Potter IY, Pittelkow MR (1999) Сложный эфир форбола с высокой плотностью клеток и ретиноевая кислота активируют инволюкрин и подавляют супрабазальный кератин 10 в аутокринных культурах эпидермальных кератиноцитов человека. Mol Cell Biol Res Comm: MCBRC 2: 138–144.
  56. 56. Длугош А.А., Юспа С.Х. (1993) Координационные изменения в экспрессии генов, которые отмечают переход от остистых к гранулярным клеткам в эпидермисе, регулируются протеинкиназой С.J Cell Biol 120: 217–225.
  57. 57. Jensen UB, Lowell S, Watt FM (1999) Пространственная взаимосвязь между стволовыми клетками и их потомством в базальном слое эпидермиса человека: новый взгляд, основанный на цельномасштабной маркировке и анализе клонов. Развитие 126: 2409–2418.
  58. 58. Lavker RM, Sun TT (1982) Гетерогенность в базальных кератиноцитах эпидермиса: морфологические и функциональные корреляции. Наука 215: 1239–1241.
  59. 59. Газизаде С., Тайчман Л.Б. (2005) Организация стволовых клеток и их потомков в эпидермисе человека.J Invest Dermatol 124: 367–372.
  60. 60. Kose O, Lalli A, Kutulola AO, Odell EW, Waseem A (2007) Изменения экспрессии маркеров стволовых клеток в плоском лишае полости рта и гиперкератотических поражениях. J Oral Sci 49: 133–139.
  61. 61. Kose O, Stewart J, Waseem A, Lalli A, Fortune F (2008) Экспрессия цитокератинов, молекул адгезии и активации в язвах полости рта при болезни Бехчета. Clin Exp Dermatol 33: 62–69.
  62. 62. Klein CE, Steinmayer T, Mattes JM, Kaufmann R, Weber L (1990) Интегрины нормального эпидермиса человека: дифференциальная экспрессия, синтез и молекулярная структура.Брит Дж. Дерматол 123: 171–178.
  63. 63. Хонг Дж., Ли Дж., Мин К. Х., Уокер Дж. Р., Петерс Э. К. и др. (2007) Идентификация и характеристика низкомолекулярных индукторов дифференцировки эпидермальных кератиноцитов. ACS Chem Biol 2: 171–175.
  64. 64. Ефимова Т., Экерт Р.Л. (2000) Регулирование активности промотора инволюкрина человека новыми изоформами протеинкиназы С. J Biol Chem 275: 1601–1607.
  65. 65. Efimova T, Deucher A, Kuroki T, Ohba M, Eckert RL (2002) Новые изоформы протеинкиназы C регулируют дифференцировку кератиноцитов человека, активируя каскад протеинкиназы p38 delta, активируемый митогеном, который нацелен на CCAAT / связывающий энхансер белок альфа.J Biol Chem 277: 31753–31760.
  66. 66. Kashiwagi M, Ohba M, Chida K, Kuroki T (2002) Протеинкиназа C eta (PKC eta): ее участие в дифференцировке кератиноцитов. J Biochem 132: 853–857.
  67. 67. Adhikary G, Chew YC, Reece EA, Eckert RL (2010) PKC-delta и -eta, MEKK-1, MEK-6, MEK-3 и p38-delta являются важными медиаторами реакции нормальных эпидермальных кератиноцитов человека на дифференциацию агенты. Дж. Инвест Дерматол 130: 2017–2030.
  68. 68.Камиока Н., Акахане Т., Коно Ю., Куроки Т., Иидзима М. и др. (2010) Протеинкиназа C дельта и эта по-разному регулируют экспрессию лорикрина и белков семейства Jun в кератиноцитах человека. Biochem Biophys Res Comm 394: 106–111.
  69. 69. Eckert RL, Welter JF (1996) Регулирование транскрипционного фактора экспрессии генов эпидермальных кератиноцитов. Mol Biol Rep 23: 59–70.
  70. 70. Ma S, Rao L, Freedberg IM, Blumenberg M (1997) Транскрипционный контроль генов кератина K5, K6, K14 и K17 членами семейства AP-1 и NF-kappaB.Экспрессия гена 6: 361–370.
  71. 71. Кулеш Д.А., Сесена Г., Дармон Ю.М., Вассер М., Осима Р.Г. (1989) Посттрансляционная регуляция кератинов: деградация кератинов мыши и человека 18 и 8. Mol Cell Biol 9: 1553–1565.
  72. 72. Crowe DL (1993) Ретиноевая кислота опосредует посттранскрипционную регуляцию уровней мРНК кератина 19. J Cell Sci 106: 183–188.
  73. 73. Tyner AL, Fuchs E (1986) Доказательства посттранскрипционной регуляции кератинов, экспрессируемых во время гиперпролиферации и злокачественной трансформации в эпидермисе человека.J Cell Biol 103: 1945–1955.
  74. 74. Папп Х., Цифра Дж., Лазар Дж., Гонци М., Чернох Л. и др. (2003) Изоферменты протеинкиназы C регулируют пролиферацию и дифференцировку, опосредованную высокой плотностью клеток, в кератиноцитах HaCaT. Exp Dermatol 12: 811–824.
  75. 75. Lee YS, Yuspa SH, Dlugosz AA (1998) Дифференциация культивируемых эпидермальных кератиноцитов человека при высокой плотности клеток опосредуется эндогенной активацией сигнального пути протеинкиназы C. J Invest Dermatol 111: 762–766.
  76. 76. Рутберг С.Е., Саез Э., Глик А., Длугош А.А., Шпигельман Б.М. и др. (1996) Дифференциация кератиноцитов мышей сопровождается PKC-зависимыми изменениями белков AP-1. Онкоген 13: 167–176.
  77. 77. Рутберг С.Е., Саез Э., Ло С., Джанг С.И., Маркова Н. и др. (1997) Противоположная активность c-Fos и Fra-2 в отношении AP-1 регулируемой транскрипционной активности в кератиноцитах мыши, индуцированной к дифференцировке с помощью эфиров кальция и форбола. Онкоген 15: 1337–1346.
  78. 78.Verma AK, Wheeler DL, Aziz MH, Manoharan H (2006) Протеинкиназа Cepsilon и развитие плоскоклеточного рака, немеланомного рака кожи человека. Мол канцероген 45: 381–388.
  79. 79. Тех М.Т., Вонг С.Т., Нил Г.В., Гали Л.Р., Филпотт М.П. и др. (2002) FOXM1 является нижестоящей мишенью Gli1 в базальноклеточных карциномах. Cancer Res 62: 4773–4780.
  80. 80. Ghali L, Wong ST, Green J, Tidman N, Quinn AG (1999) Белок Gli1 экспрессируется в базальноклеточных карциномах, кератиноцитах наружной корневой оболочки и субпопуляции мезенхимальных клеток в нормальной коже человека.J Invest Dermatol 113: 595–599.
  81. 81. Wierstra I, Alves J (2007) FOXM1, типичный фактор транскрипции, связанный с пролиферацией. Biol Chem 388: 1257–1274.
  82. 82. Huynh KM, Soh JW, Dash R, Sarkar D, Fisher PB, et al. (2011) Экспрессия FOXM1 опосредует подавление роста во время терминальной дифференцировки метастатических клеток меланомы человека HO-1. J Cell Physiol 226: 194–204.
  83. 83. Myatt SS, Lam EW (2007) Новые роли белков вилочного бокса (Fox) при раке.Нат Рев Рак 7: 847–859.
  84. 84. Gemenetzidis E, Bose A, Riaz AM, Chaplin T, Young BD, et al. (2009) Активация FOXM1 является ранним явлением при плоскоклеточной карциноме человека и усиливается никотином во время злокачественной трансформации. PLoS One 4: e4849.
  85. 85. Waseem A, Ali M, Odell EW, Fortune F, Teh MT (2010) Последующие мишени FOXM1: CEP55 и HELLS являются маркерами прогрессирования рака плоскоклеточного рака головы и шеи. Устный Онкол 46: 536–542.
  86. 86. Freedberg IM, Tomic-Canic M, Komine M, Blumenberg M (2001) Кератины и цикл активации кератиноцитов. J Invest Dermatol 116: 633–640.
  87. 87. Dickson MA, Hahn WC, Ino Y, Ronfard V, Wu JY и др. (2000) Кератиноциты человека, которые экспрессируют hTERT, а также обходят механизм p16 (INK4a), который ограничивает продолжительность жизни, становятся бессмертными, но сохраняют нормальные характеристики роста и дифференцировки. Mol Cell Biol 20: 1436–1447.
  88. 88. Boukamp P, Petrussevska RT, Breitkreutz D, Hornung J, Markham A, et al.(1988) Нормальное ороговение в спонтанно иммортализованной линии анеуплоидных клеток кератиноцитов человека. J Cell Biol 106: 761–771.

Паромомицин влияет на трансляцию и оборот, опосредованный везикулами, как показывает протеомика паромомицина — чувствительная — резистентная Leishmania donovani

PLoS One. 2011; 6 (10): e26660.

, 1 , 1 , 2 , 2 и 1 , *

Бхавна Чавла

1 Школа наук о жизни, Университет Джавахарлала Неру, Нью-Дели, Индия,

Анупам Джингран

1 Школа наук о жизни, Университет Джавахарлала Неру, Нью-Дели, Индия,

Ашвини Паниграхи

2 Сиэтл Биомед, Сиэтл, Вашингтон, Соединенные Штаты Америки,

Кеннет Д.Стюарт

2 Сиэтл Биомед, Сиэтл, Вашингтон, Соединенные Штаты Америки,

Аренда Мадхубала

1 Школа наук о жизни, Университет Джавахарлала Неру, Нью-Дели, Индия,

Томас Дж. Темплтон, редактор

1 Школа наук о жизни, Университет Джавахарлала Неру, Нью-Дели, Индия,

2 Сиэтл Биомед, Сиэтл, Вашингтон, Соединенные Штаты Америки,

Медицинский колледж Вейл Корнелл, Соединенные Штаты Америки

Задумал и спроектировал эксперименты: RM KS AP.Проведены эксперименты: BC AJ. Проанализированы данные: RM BC AJ. Предоставленные реагенты / материалы / инструменты анализа: RM KS. Написал статью: RM BC.

Поступило 27.06.2011; Принято 30 сентября 2011 г.

Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии надлежащего указания автора и источника.

Эта статья цитируется в других статьях в PMC.
Дополнительные материалы
Таблица S1: Список белков, идентифицированных в наборах A и B с достоверностью ≥95%.

(XLS)

GUID: CFDECD62-D542-4266-9091-91E9D8E586C7

Таблица S2: Белки, идентифицированные с помощью SILAC и классифицированные на основе функции, количественно определяемой с достоверностью> 95% и имеющих ≥2 пептидов.

(XLS)

GUID: B22741D0-5326-4585-9DB9-EDDA2FD3CEEE

Аннотация

Leishmania donovani — простейший паразит, вызывающий висцеральный лейшманиоз (ВЛ) и являющийся причиной значительной смертности и заболеваемости.Повышение устойчивости к препаратам сурьмы представляет собой серьезную проблему при химиотерапии ВЛ. Паромомицин является аминогликозидным антибиотиком и является одним из препаратов, используемых в настоящее время в химиотерапии кожного и висцерального лейшманиоза. Чтобы понять механизм действия этого антибиотика на молекулярном уровне, мы исследовали глобальные протеомные различия между штаммом AG83 дикого типа и устойчивым к паромомицину (PRr) штаммом L. donovani . Мечение стабильными изотопами аминокислот в культуре клеток (SILAC) с последующей количественной масс-спектрометрией штамма AG83 дикого типа и штамма, устойчивого к паромомицину (PRr), идентифицировало в общей сложности 226 белков с достоверностью ≥95%.Анализ данных выявил повышенную регуляцию 29 белков и понижающую регуляцию 21 белка в штамме PRr. Сравнительный протеомный анализ штаммов дикого типа и штаммов, устойчивых к паромомицину, показал повышенную регуляцию рибосомных белков в устойчивом штамме, что указывает на их роль в трансляции. Повышенные уровни гликолитических ферментов и стрессовых белков также наблюдались в штамме PRr. Наиболее важно то, что мы наблюдали повышенную регуляцию белков, которые могут играть роль во внутриклеточном выживании и везикулярном переносе штамма PRr.Кроме того, ультраструктурный анализ с помощью электронной микроскопии продемонстрировал повышенное количество везикулярных вакуолей в штамме PRr по сравнению со штаммом дикого типа. Анализ сродства к лекарственному средству с последующей масс-спектрометрией идентифицировал белки в штамме L. donovani дикого типа, которые были специфически и ковалентно связаны с паромомицином. Эти результаты дают первое полное представление о механизме действия и лежащем в основе механизма устойчивости к паромомицину у Leishmania donovani .

Введение

Паромомицин — аминогликозидный антибиотик, который первоначально использовался против бактериальной инфекции [1]. Его также применяют против лямблиоза, амебайаза [2] и криптоспоридиоза [3]. Механизм действия паромомицина хорошо изучен на E. coli . Известно, что он подавляет синтез белка, взаимодействуя с рибосомными субъединицами [1]. Также было показано, что он ингибирует антиассоциативную активность фактора инициации 3 и способствует ассоциации рибосомных субъединиц [4].Известно, что он связывается с большой бороздой в A-сайте 16S рРНК в E. coli и вызывает неправильное считывание мРНК [5].

Простейшие паразиты Leishmania являются возбудителем кала-азара и вызывают различные клинические проявления. Висцеральный лейшманиоз (ВЛ) вызывается L. donovani на индийском субконтиненте. Пятивалентные сурьмы (SbV) являются препаратами первой линии, используемыми для лечения всех форм лейшманиозных инфекций [6], [7].Устойчивость к этому препарату стала основным препятствием в лечении ВЛ во многих эндемичных регионах, особенно в Индии [8]. Парентеральный состав аминозидина (паромомицин) был одобрен для лечения лейшманиоза в Индии [9] — [11], где он проходит фазу IV испытаний (http://www.oneworldhealth.org/press_releases/release/pr_1227120528). Доказано, что он эффективен против кожного (как местное, так и парентеральное средство) и висцерального лейшманиоза (как парентеральное средство) [12], [13].

Механизм действия паромомицина в случае Leishmania не ясен. Было высказано предположение, что он может изменять текучесть мембран, взаимодействовать с рибосомами, влиять на потенциал митохондриальной мембраны и ингибировать дыхание [14]. Ранее мы выяснили эффект и механизм поглощения паромомицина у Leishmania donovani [15]. Линия, отобранная по устойчивости к лекарственному средству, показала снижение накопления паромомицина, связанное со значительным снижением начального связывания с поверхностью клетки.Вызванное лекарством снижение мембранного потенциала и ингибирование синтеза белка были менее выражены у устойчивого штамма по сравнению с штаммом дикого типа [15]. Недавнее сообщение указывает на различные эффекты паромомицина на процессы трансляции паразита Leishmania и его млекопитающих-хозяев [16].

Устойчивость к лекарствам — это многофакторная проблема, связанная с изменениями уровней экспрессии и активности большого количества белков. К сожалению, количественная оценка уровней мРНК между лекарственно-устойчивыми и лекарственно-чувствительными клеточными линиями не всегда коррелирует с уровнями экспрессии белка из-за посттранскрипционных изменений в содержании белка.Следовательно, необходимы глобальные количественные протеомные скрины для идентификации белков-мишеней, которые дифференциально экспрессируются в линиях клеток, устойчивых к лекарствам. Профилирование белков ранее применялось для понимания стадийно-специфической экспрессии генов, механизма устойчивости к лекарствам, идентификации факторов вирулентности и характеристики иммунодоминантных антигенов [17] — [20]. Более ранние отчеты о сравнительном профилировании белков дикого типа и штамма, устойчивого к сурьме, показали, что белок теплового шока и кинетопластидные белки, родственные кальпаину, модулируют восприимчивость к сурьме [21].В другом исследовании были выявлены новые роли метионин аденозилтрансферазы в устойчивости к метотрексату у Leishmania [18].

Чтобы понять механизм действия и возможный механизм устойчивости этого антибиотика на молекулярном уровне, мы исследовали профиль экспрессии белка генетически связанной пары штаммов, чувствительных / устойчивых к паромомицину. Количественный протеомный подход, основанный на маркировке стабильными изотопами аминокислот в культуре клеток (SILAC) с последующей масс-спектрометрией высокого разрешения, был использован для анализа различий протеома дикого типа и штамма, устойчивого к PRr.Промастиготы, устойчивые к паромомицину, были созданы ранее при ступенчатом воздействии паромомицина, и было обнаружено, что устойчивость к ним в три раза выше по сравнению с промастиготами дикого типа [15]. Анализ сродства к лекарственному средству с последующей масс-спектрометрией выявил ряд белков в L. donovani , которые могут взаимодействовать с паромомицином. Вероятно, тогда интернализация происходит за счет эндоцитоза, как сообщалось в наших более ранних исследованиях [15]. Повышающая регуляция белков, вовлеченных в везикулярный транспорт в штамме PRr, дополнительно поддерживает секвестрацию лекарственного средства в везикулярном цитоплазматическом компартменте.Ультраструктурные исследования продемонстрировали повышенное количество везикулярных вакуолей в штамме PRr по сравнению со штаммом дикого типа. Повышающая регуляция белков, участвующих в трансляционном аппарате, особенно рибосомных белков в штамме PRr, указывает на то, что попадание в клетку PR ингибирует синтез белка, нацеливаясь на рибосомные белки. Выявленные белки паразитов дают представление о способе действия и лежащем в основе механизме устойчивости к паромомицину у Leishmania. Кроме того, он позволил нам переосмыслить и расширить более ранние результаты, выявив дополнительные процессы, которые до сих пор только подозревались в их способе действия и лежащем в основе механизме устойчивости у L. donovani.

Результаты

Идентификация белков, дифференциально экспрессируемых в штамме дикого типа (WT) и штамме, устойчивом к паромомицину (PRr)

Мы сравнили протеом штамма дикого типа (WT) AG83-S со штаммом PRr. Сравнительные протеомные исследования с использованием технологии SILAC были использованы для выявления белков, которые участвуют в опосредовании лекарственной устойчивости.Вкратце, штаммы WT и PRr культивировали в среде с добавлением нормальных аминокислот [L-лизин (70 мг / л) и L-аргинин (70 мг / л)] и меченными изотопами 13 C 6 L -лизин-HCl и 13 C 6 15 N 4 L-аргинин-HCl соответственно. Схема, иллюстрирующая схему эксперимента, показана на рис. Равное количество белка (100 мкг) из чувствительных и устойчивых штаммов смешивали и подвергали хроматографии первого измерения, и массы пептидов, полученные в результате масс-спектрометрического анализа, охарактеризовали с использованием L.Infantum V3 протеом версии 3.0 (ftp://ftp.sanger.ac.uk/pub/pathogens/L_infantum/). Дополнительная таблица S1 во вспомогательной информации включает все идентификаторы белков с достоверностью ≥95% из двух отдельных наборов данных с их соответствующими соотношениями и p-значениями. Всего было идентифицировано 226 различных белков, из которых 197 белков имели известную или предсказанную функцию, а 29 белков не имели известной функции (гипотетические белки). Дополнительная таблица S2 включает объединенные наборы данных и функциональную аннотацию всех неизбыточных белков, идентифицированных с достоверностью ≥95% и ≥2 пептидов.Согласно функциональному описанию, все идентифицированные белки попали в 7 основных групп: клеточный цитоскелет, метаболические ферменты, шапероны / стрессовые белки, трансляция, белки, участвующие во внутриклеточном выживании, процессинг РНК и ДНК, трансдукция сигнала и гипотетические белки. Относительное распределение белков показано на. Хиты с повышенным и пониженным регулированием объединены в каждой группе.

Схема эксперимента SILAC.

Клетки, устойчивые к паромомицину (PRr) и AG83 дикого типа (WT), выращивали на изотопически тяжелых и легких средах соответственно.Клетки обоих штаммов лизировали и объединяли лизаты легких и тяжелых клеток. Образцы белка восстанавливали, алкилировали и расщепляли трипсином до образцов пептидов, которые затем анализировали с помощью ЖХ-МС / МС. Количественную оценку пар пептидов SILAC проводили с помощью алгоритма SEQUEST для базы данных белков L. infantum версии 3.0 (ftp://ftp.sanger.ac.uk/pub/pathogens/L_infantum/). Файлы вывода SEQUEST были проанализированы и проверены PeptideProphet.

Круговая диаграмма, показывающая распределение белков Leishmania , идентифицированных методом количественной протеомики с использованием мечения стабильных изотопов аминокислотами в культуре клеток (SILAC) в сочетании с масс-спектрометрией для количественной оценки изменений уровней белка между устойчивыми к паромомицину (PRr) и чувствительными клетками.

Белки были сгруппированы в соответствии с их клеточными функциями. Хиты с повышенным и пониженным регулированием объединены в каждой группе.

Среди белков, подвергнутых строгой количественной оценке, мы определили следующие пороги для выбора белков, экспрессия которых значительно изменилась: 1) белки, идентифицированные программным обеспечением, с достоверностью ≥95%; 2) соотношение составляет ≥1,5 или ≤0,5 и 3) белки, содержащие ≥2 пептида. Применяя эти критерии фильтрации, были идентифицированы подмножества регулируемых белков, а затем было определено общее количество идентификаторов белков и количество регулируемых совпадений (отвечающих всем трем требованиям), обнаруженных в эксперименте, как подробно описано в разделе методов.Белки, которые были ≥1,5 раза, считались активированными, тогда как белки, которые были ≤0,5 раза, считались понижающими. Используя эти строгие параметры, было обнаружено, что 29 белков имеют повышенную регуляцию, а 21 белок — пониженную, а остальные белки остаются неизменными в штамме PRr по сравнению со штаммом дикого типа (и). показывает процент белков с повышенной и пониженной регуляцией на основе их функциональной классификации.

Столбиковая диаграмма, показывающая белки, которые подвергались повышенной / понижающей регуляции в штамме, устойчивом к PR.

Белки были сгруппированы в соответствии с клеточными функциями на основе отдельных пептидов, количественно определяемых с достоверностью ≥95% и имеющих ≥2 пептида.

Таблица 1

Активная регуляция белков в штамме, устойчивом к паромомицину (PRr).

12 12 4,82612 4,82612 900 13 12 0,42612 900 6.65E-04 926.0812 25 2 Везикул Lin20J20 АТФаза, предположительно 926 0,5
S. No. Регистрационный номер Название белка (повышенная регуляция) Соотношение PRr: WT P-значение Процентное покрытие Общее количество пептидов
Перевод
1 LinJ15_V3.1530 Рибосомный белок S6, предположительно 1,57 ± 0,4 4,21E-01 34,9 6
2 LinJ28_V3.0570LinJ30_V3.3240 Рибосомный белок s26 9,3240 900 ± 0,6 2.05E-02 15.2 2
3 LinJ28_V3.1050LinJ30_V3.3650 40S рибосомный белок S14 1.65 ± 1 5.39E-01 14,2
900 4 LinJ32_V3.0930LinJ35_V3.0600 60S рибосомный белок L18a, предположительно 1,56 ± 0,3 4.07E-01 6,7 3
5 LinJ36_V3852 58,8 5
Метаболические ферменты
Гликолиз
6 LinJ14_V3.1240 Энолаза 2.4 67,8 9
7 LinJ21_V3.0300LinJ21_V3.0310 Гексокиназа, предположительно 1,5 ± 1,1 6.52E-01 10,6 82612 82985 10,6

LinJ24_V3.0870

Триозофосфат-изомераза 1,51 ± 0,5 5.06E-01 10,8 9
9 LinJ30_V3.2990LinJ3085_V3.3000 Глидегендицерофосфат94 ± 0,6 2,68E-01 30,2 138
10 LinJ36_V3.6960 2,3-бисфосфоглицератнезависимая фосфоглицерат мутаза 1,57 ± 0,6 2
Другие метаболические ферменты
11 LinJ16_V30560 Оротидин-5-фосфатдекарбоксилаза / оротатфосфорибозилтрансфераза, предположительно 1.56 ± 0,5 4.66E-01 12 21
12 LinJ24_V3.0780 Яблочный фермент 1,78 ± 1,5 5.52E-01 4,6 3 LinJ27_V3.0300 Ацильный протеин-носитель, предположительно 1,78 ± 0,2 2.67E-01 12 4
14 LinJ30_V3.3560LinJ30_V122612 LinJ30_V3.3560LinJ30_V3128-синтаза 98526 98526 98526 Синтетаз85 1.63 ± 0,07 3,38E-01 2,3 2
Шапероны / стресс-белки
15 LinJ26_V3.1220 Белок теплового шока, связанный с 70 2,11 ± 0,2 1.50E-01 15,8 7
16 LinJ28_V12.30 Тепло LinJ28_V3.30 60 шоковый белок hsp70, предположительно 2,5467 62,5 10
17 LinJ30_V3.2480 Белок 1, связанный с тепловым шоком 70, митохондриальный предшественник, предполагаемый 2,01 49,7 3
18 LinJ32_V3.3470 Альфа-субъединица шаперонина, предположительно 7.9 5
19 LinJ36_V3.7240 Шаперонин, предполагаемый 2,26 ± 0,2 1.16E-01 7,8 6
Обработка ДНК / РНК
20 LinJ35_V3.2240 РНК-связывающий белок, предположительно 1,5 ± 0,7 5.71E-01 12,4 8
21 LinJ36_V3.3960 Базовый фактор транскрипции 3a, предположительно 2,68 ± 0,9 1.07E-01 35 17
Белки, участвующие во внутриклеточном выживании / процессинге
22 LinJ11_V3.0350 14-3-3 белок, предположительно 1.64 ± 0,6 4,41E-01 13,4 7
23 LinJ12_V3.0730 NADH: флавин оксидоредуктаза / NADH оксидаза, предположительно 2,89 ± 2,7 3,13E-01 3,13E-01 900 5
24 LinJ19_V3.0150 Аминопептидаза, предполагаемая 1,73 ± 0,2 2,93E-01 11,1 6
2.8 ± 0,4 5.21E-02 6,1 3
26 LinJ24_V3.1560LinJ24_V3.1570 IgE-зависимый гистамин-высвобождающий фактор, предположительно 1,75 ± 0,2 2.88E-01 900 5,3 2
27 LinJ28_V3.2610 Вакуолярная субъединица B АТФ-синтазы, предположительно 1,64 ± 1,2 5.75E-01 4,8 2
.0790 Биосинтетический белок липофосфогликана, предположительно 2,01 ± 0,2 1.77E-01 5,6 3
29 LinJ36_V3.3360 14-3-312 протеиноподобный белок 6 4,59E-01 22,9 10

Таблица 2

Белки, подавленные в штамме, устойчивом к паромомицину (PRr).

_9V2612 Lin рибосомный белок L32 2 Lin19035_V 2 Lin19035_V -зависимая фумаратредуктаза, предположительно 2 LinJ35_V.3900 2 Lin90J19_V 2 Lin90J19_V Фибрилларин, предположительно
S. No. Регистрационный номер Название белка (пониженная регуляция) Соотношение PRr: WT Значение P Процентное покрытие Общее количество пептидов
Перевод
1 LinJ11_V3.1160 Фактор высвобождения эукариот 3, предполагаемый 0,17 1.45E-03 5,3 3
2 LinJ18_V3.06303osal LinJ18_V3.0630LinJ950 белок L10a, предположительно 0.24 ± 0,2 1.99E-01 22 5
3 LinJ22_V3.1370LinJ22_V3.1410 40S рибосомный белок L14, предположительно 0,23 ± 0,1 8.2012E-03 4
4 LinJ30_V3.0470 Аспартил-тРНК синтетаза, предположительно 0,09 ± 0,01 8.88E-06 3,6 3
5 0.27 ± 0,2 1.88E-01 31,6 5
Клеточный цитоскелет
6 LinJ14_V3.1190 Кинезин K39, предполагаемый 0,3 ± 0,04 2.4026E 7,3 2
Метаболические ферменты
Гликолиз
7 LinJ20_V3.0110LinJ20_V3.0120 Фосфоглицераткиназа C, гликозомная 0.1 ± 0,1 6,67E-02 19,1 14
цикл Кребса
8 LinJ35_V3.0850 НАДН-зависимый фумаратредуктазоподобный белок 0,47 ± 0,07 1,62E-01 2,3 3
9 0,24 ± 0,02 5,57E-03 8,5 6
Цепь транспортировки электронов
10 LinJ05_V3.0500LinJ05_V3.0510 Альфа-субъединица АТФазы 0,45 ± 0,27 3.12E-01 18,8 16
11 LinJ12_V3.0620 Цитохром c-оксидаза 0,26 0,26 9001 0,2612 Субъединица E-01 7,4 2
Другие метаболические ферменты
12 LinJ31_V3.2320 3,2-транс-еноил-КоА-изомераза, митохондриальный предшественник, предположительно 0.39 ± 0,03 6,69E-02 8,8 2
13 LinJ35_V3.3390 6-фосфоглюконатдегидрогеназа, декарбоксилирующая предполагаемая 0,36 ± 0,03 85 0,36 ± 0,03 4,79 3
Шапероны / стресс-белки
14 LinJ21_V3.1330 Т-комплексный белок 1, дельта-субъединица, предположительно 0,47 ± 0,03 1,40E-01 12 4
15 t-комплексный белок 1, эта субъединица, предположительно 0,42 ± 0,1 1.09E-01 15,6 6
Обработка ДНК / РНК
16 LinJ15_V3.1500 Ядерный антиген пролиферативных клеток (PCNA), предполагаемый 0,27 ± 0,1 2,87E-02 11,6 3
17 0.45 ± 0,1 1,69E-01 12,2 2
18 LinJ32_V3.0410 АТФ-зависимая РНК-геликаза, предполагаемая 0,27 ± 0,2 1,58E-01 11,9 11,9 6
Белки, участвующие во внутриклеточном выживании / процессинге
19 LinJ35_V3.0070 Prohibitin, предположительно 0,4 ± 0,03 7.79E-02 7,9 2
Гипотетические белки
20 LinJ10_V3.0910 Гипотетический белок, консервативный 0,47 ± 0,1 1.48E-01 12,8 2
21 LinJ35_V3.0140 Гипотетический белок, консервативный 26 0,22 ± 0,2 26 0,22 ± 0,2 26 0,22 ± 0,2 26 0,22 ± 0,2 26 0,22 ± 0,2 01 21,8 3

Повышенный гликолиз и метаболические пути производства энергии в штамме, устойчивом к паромомицину (PRr)

Leishmania в основном использует ферменты гликолитического и пентозофосфатного путей для выработки энергии.Несколько обогащенных биологических путей из подгруппы белков, идентифицированных с повышенной экспрессией в устойчивом к паромомицину L. donovani , связаны с гликолизом. Было обнаружено, что ферменты гликолитического пути значительно активированы в штамме PRr, за исключением фермента фосфоглицераткиназы, которая, как было обнаружено, снижена (~ 10 раз) в штамме, устойчивом к PR. Было обнаружено, что другие белки, такие как предполагаемая НАДН-зависимая фумаратредуктаза и НАДН-зависимый белок, подобный фумаратредуктазе, подавлены (в ~ 4 и ~ 2 раза соответственно) в устойчивых к паромомицину клетках.Этот фермент участвует в превращении фумарата в сукцинат и позволяет организму переключиться на анаэробное дыхание. Было обнаружено, что протеин 6-фосфоглюконатдегидрогеназа, первый коммитированный фермент пентозофосфатного пути, у паразитов, устойчивых к паромомицину, снижается (~ 2,7 раза). Это указывает на то, что штамм PRr в значительной степени зависит от гликолиза для удовлетворения своих потребностей в энергии. Повышенная гликолитическая активность в нормальных аэробных условиях, вероятно, связана с дисфункцией митохондрий.Высокая скорость гликолиза также помогает снизить окислительный стресс, поскольку продукт анаэробного гликолиза, пируват, является поглотителем гипероксида.

Дополнительные метаболические пути, обогащенные ферментами, демонстрирующими измененные уровни экспрессии, включают цикл TCA и метаболизм липидов. Было обнаружено, что белки, участвующие в окислительном фосфорилировании, альфа-субъединице АТФазы и субъединице IV цитохром-с-оксидазы, подавлены в штамме PRr. Было обнаружено, что ацильный белок-носитель, который является частью пути синтеза жирных кислот II типа, имеет повышенную регуляцию (∼1.В 8 раз) в штамме PRr. Этот путь используется для биосинтеза липоевой кислоты, которая является важным кофактором митохондриальных ферментов пируватдегидрогеназы и 2-кетоглутаратдегидрогеназы, присутствующих в цикле TCA [22]. Было обнаружено, что другой фермент, S-аденозилметионинсинтетаза, имеет повышенную регуляцию на ~ 1,6% в штамме PRr. S-аденозилметионин-зависимая РНК-метилаза, которая метилирует 16S рРНК в E. coli , была связана с устойчивостью к касугамицину, ингибитору синтеза белка [23].

Модуляция белков, участвующих в внутриклеточном выживании, процессинге и вирулентности

Везикулярная секвестрация лекарств — хорошо известный механизм лекарственной устойчивости в некоторых клеточных линиях млекопитающих, который приводит к снижению цитоплазматических уровней лекарств за счет секвестрации лекарств в везикулярный цитоплазматический компартмент. [24] — [26]. Устойчивость к лекарствам за счет секвестрации в везикулах также была предложена для устойчивых к сурьме паразитов Leishmania . В Leishmania трехвалентная сурьма конъюгируется с трипанотионом и изолируется внутри вакуоли переносчиком ABC (АТФ-связывающая кассета), P-гликопротеином A (PGPA) [27].Мы наблюдали повышающую регуляцию как слитой с пузырьками АТФазы (~ 2,8 раза), так и субъединицы В вакуолярной АТФ-синтазы (~ 1,6 раза) в штамме PRr.

Просвечивающая электронная микроскопия использовалась для документирования различий между диким типом и штаммом PRr. Ультраструктурный анализ устойчивого к паромомицину штамма выявил большее количество везикулярных вакуолей по сравнению с чувствительным штаммом дикого типа (). Возможно, что везикулярная секвестрация паромомицина в вакуоли этими устойчивыми паразитами может быть вовлечена в формирование фенотипа устойчивости.

Изображения промастигот дикого типа (WT) и промастиготы, устойчивые к паромомицину B.

промастигот WT собирали и фиксировали, как указано в разделе «Материалы и методы», и подвергали анализу ПЭМ. Штамм PRr демонстрировал многочисленные вакуоли по сравнению со штаммом дикого типа. Изображения представляют 2 независимых эксперимента. FP: Жгутиковый карман; V: вакуоль; N: ядро; К: Кинетопласт.

Мы также наблюдали повышенную экспрессию белков, которые участвуют в внутриклеточном выживании и вирулентности, включая предполагаемый липофосфогликановый биосинтетический белок (LPG), аминопептидазный IgE-зависимый рилизинг-фактор гистамина и предполагаемый NADH-оксидазу.Другой белок, запретитин, показал снижение уровня экспрессии белка (~ 2,5 раза) в штамме, устойчивом к PRr. Сообщается, что Prohibitin играет важную роль в событиях, ведущих к взаимодействию Leishmania- с хозяином [28]. Его гомолог был изучен на Trypanosoma brucei и, как сообщается, активируется при индукции апоптоза [29]. Снижение регуляции prohibitin в настоящем исследовании, возможно, указывает на то, что PR-резистентные клетки способны выживать, подавляя экспрессию проапоптотических белков.Было обнаружено, что два белка, обозначенные как «14-3-3 протеиноподобный протеин» и «14-3-3 предполагаемый протеин», имеют повышенную регуляцию в штамме PRr. Эти белки способны связываться с многочисленными фосфорилированными белками, включая факторы транскрипции, ферменты биосинтеза, белки цитоскелета, сигнальные молекулы, и обладают важными антиапоптотическими характеристиками [30].

Шапероны и стрессовые белки

Ряд шаперонов и стрессовых белков показали повышенные уровни экспрессии в штамме PRr.Анализ данных выявил повышенную регуляцию уровней в штамме PRr; а именно три HSP (> 2 раза) и два шаперонина (> 2 раза). Все три HSP относятся к семейству HSP70. Было показано, что белки теплового шока придают устойчивость к лекарствам [31].

Белки, участвующие в механизме трансляции

Известно, что паромомицин связывается с небольшой субъединицей рибосом и ингибирует синтез белка [1]. Наш анализ данных показал, что три из четырех белков с повышенной активностью являются компонентами малой рибосомной субъединицы.Всего с помощью SILAC было идентифицировано 56 белков, участвующих в трансляции, включая белки рибосомных субъединиц и факторы трансляции. Повышающая регуляция рибосомных белков rpS26 (~ 3,5 раза) и rpS6 (~ 1,57 раза) была обнаружена в штамме, устойчивом к паромомицину. Эти два белка также участвуют в регуляции самотрансляции у людей. Было показано, что рибосомный белок rpS26 важен для нормального роста S. cerevisiae [32]. Рибосомный белок, предположительно rpL18a, участвует в регуляции роста клеток и, как было установлено, имеет повышенную регуляцию (~ 1.5 раз). Было обнаружено, что трансляционный фактор EF3 подавляется в штамме, устойчивом к паромомицину (~ 5,88 раза).

Белки, участвующие в процессинге ДНК / РНК

Было также идентифицировано несколько белков, участвующих в транскрипции, включая некоторые гистоны, которые важны для репликации ДНК и сборки нуклеосом. Было обнаружено, что основной фактор транскрипции 3a (BTF3a) имеет повышенную регуляцию в ~ 3 раза. Было замечено, что подавление BTF3a участвует в ингибировании транскрипции и синтеза белков в апоптотических клетках K562 [33].Он также действует как регулятор транскрипции и связан с апоптозом и / или остановкой клеточного цикла [34], [35]. Было обнаружено, что два белка, ассоциированных с нуклеиновой кислотой, участвующих в процессинге РНК, значительно подавляются в случае штамма, устойчивого к PR. Было обнаружено, что фибрилларин, ключевой белок малых ядрышек у эукариот, который играет важную роль в биогенезе рибосом, в штамме, устойчивом к PR, подавляется примерно в 2,2 раза [36]. Фибрилларин (NOP1) высоко консервативен на протяжении всей эволюции от одноклеточных организмов, таких как дрожжи и трипаносомы, до человека [37].Он участвует в процессинге и модификации рРНК в Trypanosoma brucei [38]. Нокаут NOP1 является летальным для S. cerevisiae , и мутанты этого гена обнаруживают дефекты процессинга пре-рРНК, модификации и сборки рибосом [39].

Анализ сродства к лекарственному средству для белков, взаимодействующих с паромомицином

Комбинация анализов с понижением аффинности лекарственного средства с расщеплением in situ и анализом ЖХ-МС / МС также является полезным инструментом для получения сложной информации о первичной мишени лекарственного средства. в качестве его белковых взаимодействующих.Анализ методом Pull down с использованием PR-связанной смолы с последующим анализом LC-MS / MS выявил ряд белков при анализе LC-MS / MS, которые могут взаимодействовать с PR внутри клетки. Основная схема эксперимента показана на рисунке. Данные, полученные для PR-связанных и несвязанных смол, сравнивали для получения белков, которые связывались исключительно с PR-связанной смолой. Идентифицированные белки, которые взаимодействовали с PR, перечислены в. Особый интерес вызвали белки парафлагеллярных палочек 1D и 2C, обнаруженные только в жгутике паразитов [40].Другой белок, запретитин, также взаимодействует с PR. Prohibitin в Leishmania , как сообщается, концентрируется на поверхности жгутика и афлагелларного полюса [28]. Мембрана жгутикового кармана — единственная часть поверхности клетки, которая поддерживает эндоцитоз и экзоцитоз [41]. Настоящие данные также подтверждают роль такого процесса в поглощении лекарств. Другой белок, предполагаемый АТФазой P-типа H + , также был обнаружен во взаимодействии с PR. Сообщается, что этот белок локализован во внутриклеточных компартментах, участвует в закислении и является частью эндоцитарного пути у Trypanosoma cruzi [42].Возможно, PR взаимодействует с этим белком после того, как он подвергается эндоцитозу или секвестрируется паразитом в пузырьках.

Обзор анализа снижения аффинности с использованием PR-связанной смолы.

Паромомицин был связан со связующей смолой AminoLink Plus. Связанную PR смолу (экспериментальную) и несвязанную смолу (используемую в качестве отрицательного контроля) инкубировали с лизатом цельных клеток AG83. Затем шарики промывали и смолу наносили на 10% гель SDS-PAGE. Гель окрашивали сиррорубином, фрагменты вырезали и расщепляли трипсином.Образцы белка анализировали с помощью LC-MS / MS и сравнивали результаты для определения белков, которые избирательно взаимодействовали с PR.

Таблица 3

Анализ сродства к лекарственному средству с перевариванием in situ и анализ ЖХ-МС / МС идентифицировали белки промастиготов дикого типа L. donovani , которые связываются с паромомицином.

, LinJ18_ 9V310 2 2 0,95

Борьба с лейшманиозом в основном зависит от нескольких химиотерапевтических агентов, и возникающая резистентность к этим агентам является сегодня одной из основных клинических проблем. Паромомицин, аминогликозидный антибиотик, является одним из препаратов, используемых в настоящее время в химиотерапии кожного и висцерального лейшманиоза.Паромомицин подавляет синтез белка, взаимодействуя с субъединицами рибосомной РНК [1]. Однако его механизм действия у Leishmania spp. Сообщается, что паромомицин может действовать, взаимодействуя с рибосомами или нарушая потенциал митохондриальной мембраны [14], [15]. Чтобы понять механизм действия этого антибиотика на молекулярном уровне, мы использовали метод количественной протеомики с использованием мечения стабильных изотопов аминокислотами в культуре клеток (SILAC) в сочетании с масс-спектрометрией для количественной оценки изменений в уровнях белка между резистентными к паромомицину (PRr ) и чувствительные клетки.

Ранее мы выяснили эффект и механизм поглощения паромомицина у Leishmania donovani [15]. Наша более ранняя работа предполагает связывание катионного паромомицина с отрицательно заряженным лейшманиальным гликокаликсом. Сообщается, что у бактерий аминогликозиды связываются с липополисахаридом (ЛПС) и другими анионными компонентами поверхности бактериальных клеток [43]. Липофосфогликан (LPG), сильно отрицательно заряженная молекула, является основным компонентом клеточной поверхности промастигот Leishmania [44], [45].Сообщалось, что несколько гликозилфосфатидилинозитолов накапливаются в эндосомах [46], [47]. Ранее мы предположили, что паромомицин связывается с LPG на лейшманиальной поверхности, а также предположили, что другие компоненты также могут участвовать в связывании. Наша гипотеза заключалась в том, что после связывания с поверхностью интернализация, по-видимому, происходит за счет эндоцитоза, поскольку ряд типичных ингибиторов эндоцитоза снижает скорость поглощения лекарства [15]. Попав внутрь клетки, возможно, что лекарство попадает в митохондрии.Поглощение этого катионного агента митохондриями зависит от высокого мембранного потенциала [15].

Настоящее исследование было направлено на изучение глобальных протеомных различий между штаммом AG83 дикого типа и устойчивым к паромомицину (PRr) штаммом L. donovani . дает краткое изложение классов белков, которые были изменены в штамме, устойчивом к PR. Идентифицированные белки паразитов дополнительно подтверждают наше более раннее понимание механизма действия и лежащего в основе механизма устойчивости к паромомицину у Leishmania .Было показано, что протеомные экраны полезны для выявления новых механизмов устойчивости. Данные выявили изменения в уровне белков, участвующих в метаболических процессах, таких как гликолиз, и белков, участвующих в других фундаментальных процессах, таких как трансляция, транскрипция, передача сигнала, шапероны / стресс, внутриклеточная выживаемость и проапоптоз.

Таблица 4

Модуляция экспрессии белков в чувствительном к паромомицину (AG83 WT) и резистентном (PRr) Leishmania donovani.

S. No. Регистрационный номер Название белка Количество пептидов Вероятность Процентное покрытие
1. LinJ16_V31510, LinJ16_V31520 Парафлагелларный палочковидный протеин 2C 2 1 4.3
2. LinJ18_V3.1490, LinJ18_V3.1500, LinJ18_ 9V310 Pутативного типа 3 0,99 5,8
3. LinJ29_V3.1880, LinJ29_V3.1890 Парафлагелларный стержневой белок 1D 5 1 9,3
4. LinJ31_V3.2680 Наибольшая субъединица РНК-полимеразы II 1 0,99 1,1
5. LinJ35_V3.0070 Prohibitin 1 9385 1
Клеточная функция Было обнаружено, что белки, модулированные устойчивым к паромомицину штаммом
Внутриклеточное выживание, процессинг и вирулентность Белок 14-3-3, биосинтетический белок LPG и IgE-зависимый фактор высвобождения гистамина быть регулируемым. Было обнаружено, что активность Prohibitin снижается.
Транспортировка везикул Было обнаружено, что белки, участвующие в транспорте везикул, слиянии и эндоцитозе, подобно слиянию везикул АТФазы и вакуолярной АТФ-синтазы, имеют повышенную регуляцию.
Трансляция Было обнаружено, что рибосомные белки имеют повышенную регуляцию в штамме, устойчивом к PR. Это может быть связано с тем, что PR, как известно, ингибирует трансляцию в E. coli .
Шапероны / стрессовые белки Было обнаружено, что белки теплового шока и шаперонины имеют повышенную регуляцию. HSP защищают клетку от токсичных внешних раздражителей и участвуют в устойчивости к лекарствам.
Метаболизм Было обнаружено, что белки, участвующие в гликолизе, имеют повышенную регуляцию

Было обнаружено, что некоторые из белков, участвующих в трансляционном аппарате, особенно рибосомные белки, имеют повышенную регуляцию в устойчивом штамме ().В Leishmania паромомицин был вовлечен в прямое нацеливание на рибосомы; также сообщалось о различных эффектах паромомицина на процессы трансляции паразита Leishmania и его млекопитающих-хозяев [48]. В свете этого наши данные о повышении регуляции рибосомных белков можно объяснить как один из механизмов, используемых устойчивыми паразитами в качестве защиты от паромомицина. Кроме того, наш предыдущий отчет также показывает в целом меньший процент ингибирования синтеза белка паромомицином в штамме PRr по сравнению с WT [15].

Из белков с повышенной регуляцией в штамме PRr предполагаемый LPG заслуживает особого внимания, поскольку он был идентифицирован как фактор вирулентности у Leishmania [49]. Биосинтетический белок липофосфогликана, предположительно или LPG3 является ортологом эукариотического регулируемого белка 94 глюкозы (GRP 94). Его нулевые мутанты в Leishmania жизнеспособны, но обнаруживают серьезные дефекты фосфогликозилирования. Было обнаружено, что его роль ограничивается синтезом гликоконъюгатов, участвующих в вирулентности паразитов, включая LPG и другие PG-несущие молекулы и GPI-заякоренные белки [49].

Биосинтетический белок LPG, АТФаза слияния везикул и вакуолярная АТФаза были активированы в PR-резистентном штамме. Ультраструктурные исследования штамма, устойчивого к паромомицину, показали наличие повышенного количества везикулярных вакуолей по сравнению с чувствительным штаммом дикого типа ().

Анализ аффинности с использованием PR-связанной смолы идентифицировал белки, которые взаимодействуют с PR. Было обнаружено, что белки парафлагеллярных палочек и запретитин взаимодействуют с паромомицином. Prohibitin в Leishmania , как сообщается, также концентрируется на поверхности жгутика и афлагелларного полюса [28].Хорошо известно, что карман жгутика способствует интернализации молекул. Следовательно, связывание PR с белками парафлагеллярных палочек и prohibitin имеет значение в настоящем исследовании.

Таким образом, очевидно, что молекулярные механизмы, способствующие устойчивости к паромомицину, составляют сложную многофакторную сеть. Принимая во внимание наши предыдущие и настоящие исследования, мы предлагаем следующий механизм действия PR в L. donovani (). Предполагается, что лекарство связывается с белками парафлагеллярных палочек и запретом, а затем интернализация, по-видимому, происходит за счет эндоцитоза, поскольку ряд типичных ингибиторов эндоцитоза снижает скорость поглощения лекарства [15].Другой белок, предполагаемый АТФазой P-типа H + , также был обнаружен во взаимодействии с PR. Этот белок локализован во внутриклеточных компартментах и, как сообщается, участвует в закислении и является частью эндоцитарного пути у Trypanosoma cruzi [42]. Возможно, что PR взаимодействует с этим белком после того, как он подвергается эндоцитозу или секвестрируется в пузырьках паразитом. Везикулярная секвестрация паромомицина во внутренние везикулы паразитом с использованием флуоресцентного производного аминогликозидного антибиотика, паромомицина, потребуется, чтобы показать, что лекарство накапливается в везикулах.Возможно, что везикулярная секвестрация паромомицина в вакуоли этими устойчивыми паразитами может быть вовлечена в формирование фенотипа устойчивости. Попав внутрь клетки, PR подавляет синтез белка, нацеливаясь на несколько белков, участвующих в трансляционном аппарате, в частности, на рибосомные белки. В целом, это исследование охарактеризовало механизм действия и основной механизм устойчивости к паромомицину у Leishmania donovan i. Однако дальнейшее исследование опосредованного пузырьками механизма устойчивости к паромомицину в настоящее время продолжается в лаборатории, чтобы окончательно показать секвестрацию лекарственного средства во внутренние пузырьки устойчивых паразитов.

Предлагаемая модель механизма устойчивости к паромомицину у L. donovani .

(I) Лекарственное средство паромомицин (красные кружки) взаимодействует с парафлагеллярными белками палочек (синие кружки) и префолдином (желтые кружки) и затем поглощается промастиготами Leishmania путем эндоцитоза. Затем PR попадает в вакуоли. Обнаружено, что насос вакуолярной АТФазы активируется, и количество вакуолей увеличивается у резистентных паразитов. (II) Было обнаружено, что белки-шапероны активируются в резистентных клетках в результате стресса, вызванного паромомицином, а также участвуют в увеличении белкового обмена.(III) Было обнаружено, что количество субъединиц рибосомального белка регулируется, увеличивая общий синтез белка. (IV) Было обнаружено, что гликолитический путь активирован. Белки, отмеченные красным, представляют белки с повышенной регуляцией, а белки, отмеченные зеленым, представляют белки с пониженной регуляцией в случае штамма, устойчивого к паромомицину. Указанные ферменты: ( 1 ) гексокиназа, ( 2 ) фосфоглюкозоизомераза, ( 3 ) фосфофруктокиназа, ( 4 ) альдолаза ( 5 ) триозодефосфат-изомераза, ( 6 ) G1990 6 , ( 7 ) Фосфоглицераткиназа ( 8 ) 2,3-бисфосфоглицерат-независимая фосфоглицератмутаза, ( 9 ) Энолаза, ( 10 ) Пируваткиназа, ( 11 ) фермент глюкозы 6-фосфатдегидрогеназа.

Материалы и методы

Chemicals

Среда M199 с дефицитом L-лизина и L-аргинина была специально синтезирована из SAFC biosciences (Миссури, США). Меченые аминокислоты 13 C 6 L-лизин-HCl и 13 C 6 15 N 4 L-аргинин-HCl были получены от Pierce Biotech (Иллинойс, США). Диализированная фетальная бычья сыворотка была приобретена в Invitrogen (Калифорния, США). Трипсин масс-спектрометрии (МС) был приобретен у Promega (Висконсин, США).Смола для сочетания AminoLink была приобретена у Pierce Biotech (Иллинойс, США). Все растворители, использованные для подготовки и анализа образцов, были класса MS и были коммерчески доступны.

Паразиты и условия культивирования

Промастиготы клонов Leishmania donovani , AG83 (MHOM / IN / 80 / AG83) дикого типа (WT) и штамм, устойчивый к паромомицину (PRr), были использованы в настоящем исследовании. Штамм PRr, использованный в этом исследовании, был выращен в лаборатории, как сообщается [15]. Штамм PRr имел IC 50 145 мкМ и был в три раза устойчивым к паромомицину по сравнению с штаммом дикого типа [15].Промастиготы обычно культивировали при 22 ° C в модифицированной среде M-199 (Sigma, Сент-Луис, Миссури, США) с добавлением 10% инактивированной нагреванием фетальной бычьей сыворотки (FBS; Gibco / BRL, Life Technologies Scotland, UK) и 0,13 пенициллин и стрептомицин мг / мл.

Мечение клеток SILAC

Для анализа SILAC промастиготы выращивали в специально синтезированной среде M199, обедненной L-лизином и L-аргинином (Sigma, США), с добавлением 10% диализованной фетальной бычьей сыворотки (Invitrogen, Carlsbad, CA, США), антибиотики и один из двух составов сред SILAC при 22 ° C [нормальное содержание изотопов L-лизина (70 мг / л) и L-аргинина (70 мг / л)] для дикого типа и 13 C 6 L-лизин-HCl и 13 C 6 15 N 4 L-аргинин-HCl (Pierce Biotechnology) для паразитов PRr] ().Регулярное субкультивирование в этой среде проводили по крайней мере для шести делений клеток, чтобы достичь 100% мечения клеточных белков перед анализом.

Приготовление образцов белка

Клетки собирали, промывали 1X PBS и лизировали. Белок количественно определяли методом Брэдфорда [50], и равное количество белка (100 мкг) из обоих клеточных лизатов смешивали и разделяли с помощью 10% SDS-PAGE и окрашивали красителем Sypro Ruby (Bio-Rad). Вся полоса геля была разрезана на 10 секций для переваривания в геле.Далее каждую секцию разрезали на небольшие кусочки примерно по 1 мм каждый. Кусочки геля дегидратировали в присутствии 50% ацетонитрила, а затем регидратировали 50 мМ бикарбонатом аммония. Переваривание образцов проводили с использованием модифицированного трипсина для секвенирования (Promega) (12,5 нг / мкл) в 50 мМ бикарбонате аммония при 37 ° C в течение ночи. Затем пробирки центрифугировали и собирали супернатант. Пептиды экстрагировали из геля с использованием 20 мМ бикарбоната аммония с последующей экстракцией 5% муравьиной кислотой в 50% ацетонитриле.Образцы сушили в быстром вакууме и хранили при -80 ° C до дальнейшего анализа.

Жидкостная хроматография – масс-спектрометрия (ЖХ-МС / МС), анализ базы данных и относительное количественное определение

ЖХ-МС / МС выполняли с использованием масс-спектрометра LTQ с линейной ионной ловушкой (Thermo Fisher Scientific). Система LC состояла из иглы с наноразмерным распылением из плавленого кварца, набитой материалом C18 с обращенной фазой. Образцы пептидов загружали в колонку с обращенной фазой, используя систему растворителей с двумя подвижными фазами, состоящую из 0.4% уксусная кислота в воде (A) и 0,4% уксусная кислота в ацетонитриле (B) при скорости потока 200 мкл / мин. Масс-спектрометр работал в зависимом от данных режиме МС / МС в диапазоне m / z от 400 до 2000. Для каждого цикла пять наиболее распространенных ионов из каждого сканирования MS были выбраны для анализа MS / MS с использованием 45% нормализованной энергии столкновения. Динамическое исключение использовалось для исключения ионов, которые были обнаружены дважды в 30-секундном окне в течение 3 минут. Необработанные данные МС / МС были отправлены в Bioworks 3.3 (ThermoElectron, Сан-Хосе, Калифорния, США) и проанализированы с использованием алгоритма SEQUEST против L.База данных белков infantum , версия 3.0 (ftp://ftp.sanger.ac.uk/pub/pathogens/L_infantum/). Файлы вывода SEQUEST были проанализированы и проверены PeptideProphet. Были приняты белки и пептиды с вероятностью ≥0,9. Количественная оценка была основана на двух независимых экспериментах SILAC и LC-MS / MS.

Просвечивающая электронная микроскопия

Клетки фиксировали в растворе 2% параформальдегида и 2,5 мМ CaCl 2 в 0,1 М буфере какодилата натрия с pH 7,2, затем фиксировали в 1% тетроксиде осмия и 0.8% феррицианида калия в том же буфере, дегидратированного в ацетоне и залитого в смолу Polybed. Тонкие срезы окрашивали уранилацетатом и цитратом свинца и наблюдали под просвечивающим электронным микроскопом FEI Morgagni ™. Изображения представляют 2 независимых эксперимента.

Понижение аффинности взаимодействующих с паромомицином белков

Паромомицин (PR) был связан с связывающей смолой AminoLink plus (Pierce Biotechnology) в соответствии с протоколом производителя (смола содержит альдегидные группы, которые реагируют с первичными аминами, присутствующими в паромомицине, с образованием шиффовского базовые облигации).Несвязанный паромомицин удаляли центрифугированием смолы при 2000 об / мин и затем промыванием 1-кратным фосфатно-солевым буфером (PBS), pH 7,2. Эффективность связывания шариков с PR составила 66%. Клетки AG83 дикого типа (1 × 10 8 ) собирали и лизировали лизисным буфером (10 мМ Tris.Cl pH 7,2, 10 мМ MgCl 2 , 150 мМ KCl, 0,1% Triton-X 100, 1% BSA. и коктейль ингибиторов протеазы). Лизат инкубировали с гранулами агарозы, связанной с паромомицином, в течение 2 ч при 4 ° C при непрерывном перемешивании.Затем суспензию центрифугировали при 2000 об / мин в течение 10 минут при 4 ° C, и шарики переносили в свежую пробирку. Гранулы промывали четыре раза промывочным буфером (10 мМ Tris.Cl pH 7,2, 10 мМ MgCl 2 , 150 мМ KCl и 0,1% Triton-X 100) и, наконец, ресуспендировали в красителе 1X SDS PAGE и загружали на 10% SDS-PAGE гель. Гель окрашивали красителем Sypro Ruby, полосы визуализировали в УФ-свете, а желаемые полосы вырезали и подвергали анализу ЖХ-МС / МС в системе 4000 Q TRAP LC-MS / MS (Applied Bisosytems MDS SCIEX) для ионизации пептидов. и обнаружение.Файлы вывода SEQUEST были проанализированы и проверены PeptideProphet. Были приняты белки и пептиды с вероятностью ≥0,9. Гранулы, не связанные с паромомицином, использовали в качестве отрицательного контроля. Результаты представляют два независимых эксперимента.

Дополнительная информация

Таблица S1

Список белков, идентифицированных в наборах A и B с достоверностью ≥95%.

(XLS)

Стол S2

Белки, идентифицированные с помощью SILAC и классифицированные на основе функции, количественно определяемой с достоверностью> 95% и имеющих ≥2 пептидов.

(XLS)

Примечания

Конкурирующие интересы: Авторы заявили, что никаких конкурирующих интересов не существует.

Финансирование: Эта работа была поддержана грантом Министерства биотехнологии правительства Индии для РМ. RM является национальным научным сотрудником JC Bose при поддержке Министерства науки и технологий (DST) Индии. BC и AJ поддерживаются Советом по научным и промышленным исследованиям (CSIR) Индии. BC — стажер программы Global Infectious Diseases, поддерживаемой Международным центром Fogarty.Описанный проект также был поддержан грантом № D43TW000924 от Международного центра Фогарти для Канзас-Сити. Оборудование и помещения для этого исследования были приобретены у Applied Bio-systems, члены команды которой д-р Индраджит Каур и д-р Анну Уппал оказали техническую помощь; эта помощь признана должным образом. Финансирующие организации не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Список литературы

2. Гиллин Ф.Д., Даймонд Л.С. Подавление клонального роста Giardia lamblia и Entamoeba histolytica метронидазолом, хинакрином и другими противомикробными средствами.J Antimicrob Chemother. 1981; 8: 305–316. [PubMed] [Google Scholar] 3. Фланиган Т.П., Рамратнам Б., Грэбер С., Хеллингер Дж., Смит Д. и др. Проспективное исследование паромомицина для лечения криптоспоридиоза при СПИДе. Am J Med. 1996. 100: 370–372. S0002-9343 (97) 89499-5 [pii]; 10.1016 / S0002-9343 (97) 89499-5 [doi] [PubMed] [Google Scholar] 4. Hirokawa G, Kaji H, Kaji A. Ингибирование антиассоциативной активности фактора инициации трансляции 3 паромомицином. Антимикробные агенты Chemother. 2007. 51: 175–180. AAC.01096-06 [pii]; 10.1128 / AAC.01096-06 [doi] [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 5. Fourmy D, Recht MI, Blanchard SC, Puglisi JD. Структура A-сайта рибосомной РНК 16S Escherichia coli в комплексе с аминогликозидным антибиотиком. Наука. 1996. 274: 1367–1371. [PubMed] [Google Scholar] 6. Халил Э.А., Эль-Хасан А.М., Зийлстра Э.Е., Хашим Ф.А., Ибрагим М.Э. и др. Лечение висцерального лейшманиоза стибоглюконатом натрия в Судане: лечение тех, кто не отвечает. Ann Trop Med Parasitol. 1998. 92: 151–158.[PubMed] [Google Scholar] 7. Сундар С., Мор Д. К., Сингх М.К., Сингх В.П., Шарма С. и др. Неспособность пятивалентной сурьмы при висцеральном лейшманиозе в Индии: отчет из центра индийской эпидемии. Clin Infect Dis. 2000. 31: 1104–1107. CID000236 [pii]; 10.1086 / 318121 [doi] [PubMed] [Google Scholar] 8. Лира Р., Сундар С., Махария А., Кенни Р., Гам А. и др. Доказательства того, что высокая частота неудач лечения индийского кала-азара связана с появлением устойчивых к сурьме штаммов Leishmania donovani.J Infect Dis. 1999; 180: 564–567. JID981498 [pii]; 10.1086 / 314896 [doi] [PubMed] [Google Scholar] 9. Armijos RX, Weigel MM, Calvopina M, Mancheno M, Rodriguez R. Сравнение эффективности двух местных препаратов паромомицина и меглумина сурьмы при кожном лейшманиозе Нового Света. Acta Trop. 2004. 91: 153–160. 10.1016 / j.actatropica.2004.03.009 [doi]; S0001706X04000713 [pii] [PubMed] [Google Scholar] 10. Thakur CP, Kanyok TP, Pandey AK, Sinha GP, Messick C и др. Лечение висцерального лейшманиоза инъекционным паромомицином (аминозидином).Открытое рандомизированное клиническое исследование фазы II. Trans R Soc Trop Med Hyg. 2000. 94: 432–433. [PubMed] [Google Scholar] 11. Сундар С., Джа Т.К., Тхакур С.П., Синха П.К., Бхаттачарья СК. Паромомицин для инъекций при висцеральном лейшманиозе в Индии. N Engl J Med. 2007; 356: 2571–2581. 356/25/2571 [pii]; 10.1056 / NEJMoa066536 [doi] [PubMed] [Google Scholar] 12. el-On J, Halevy S, Grunwald MH, Weinrauch L. Местное лечение кожного лейшманиоза Старого Света, вызванного Leishmania major: двойное слепое контрольное исследование.J Am Acad Dermatol. 1992; 27: 227–231. [PubMed] [Google Scholar] 13. Скотт Дж. А., Дэвидсон Р. Н., Муди А. Х., Грант Х. Р., Фелмингем Д. и др. Аминосидин (паромомицин) в лечении лейшманиоза, завезенного в Соединенное Королевство. Trans R Soc Trop Med Hyg. 1992; 86: 617–619. [PubMed] [Google Scholar] 14. Мааруф М., де К.Ю., Браун С., Пети П.Х., Роберт-Геро М. Вмешательство паромомицина in vivo в митохондриальную активность Leishmania. Exp Cell Res. 1997; 232: 339–348. S0014-4827 (97) -X [pii]; 10.1006 / excr.1997.3500 [doi] [PubMed] [Google Scholar] 15. Джингран А., Чавла Б., Саксена С., Барретт М.П., ​​Мадхубала Р. Паромомицин: поглощение и устойчивость у Leishmania donovani. Мол Биохим Паразитол. 2009. 164: 111–117. S0166-6851 (08) 00287-9 [pii]; 10.1016 / j.molbiopara.2008.12.007 [doi] [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 16. Фернандес М.М., Мальчиоди Е.Л., Альгранати ИД. Дифференциальные эффекты паромомицина на рибосомы Leishmania mexicana и клетки млекопитающих. Антимикробные агенты Chemother. 2011; 55: 86–93. AAC.00506-10 [pii]; 10.1128 / AAC.00506-10 [doi] [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 17. Розенцвейг Д., Смит Д., Оппердос Ф., Стерн С., Олафсон Р. В. и др. Переоснащение метаболизма Leishmania: от кишечника песчаной мухи до макрофагов человека. FASEB J. 2008; 22: 590–602. fj.07-9254com [pii]; 10.1096 / fj.07-9254com [doi] [PubMed] [Google Scholar] 18. Drummelsmith J, Brochu V, Girard I., Messier N, Ouellette M. Картирование протеома простейшего паразита Leishmania и его применение для изучения мишеней лекарств и механизмов устойчивости. Протеомика клеток Mol.2003. 2: 146–155. 10.1074 / mcp.M200085-MCP200 [doi]; M200085-MCP200 [pii] [PubMed] [Google Scholar] 19. Уокер J, Acestor N, Gongora R, Quadroni M, Segura I и др. Сравнительный анализ белков определяет фактор элонгации-1бета и трипаредоксинпероксидазу как факторы, связанные с метастазированием у Leishmania guyanensis. Мол Биохим Паразитол. 2006; 145: 254–264. S0166-6851 (05) 00304-X [pii]; 10.1016 / j.molbiopara.2005.10.008 [doi] [PubMed] [Google Scholar] 20. Деа-Аюэла М.А., Рама-Инигуес С., Болас-Фернандес Ф.Протеомный анализ антигенов промастигот Leishmania infantum. Протеомика. 2006; 6: 4187–4194. 10.1002 / pmic.200600101 [doi] [PubMed] [Google Scholar] 21. Вергнес Б., Гурбал Б., Жирар И., Сундар С., Драммелсмит Дж. И др. Протеомный скрининг позволяет выявить HSP83 и небольшой кинетопластидный белок, связанный с кальпаином, в устойчивости к лекарствам клинических полевых изолятов Leishmania donovani путем модуляции запрограммированной гибели клеток, вызванной лекарственными средствами. Протеомика клеток Mol. 2007; 6: 88–101. M600319-MCP200 [pii]; 10.1074 / mcp.M600319-MCP200 [doi] [PubMed] [Google Scholar] 22.ван Велден SW, ван Хеллемонд Дж.Дж., Оппердос ФР, Tielens AG. Новые функции для частей цикла Кребса в проциклической Trypanosoma brucei, цикла, который не работает как цикл. J Biol Chem. 2005; 280: 12451–12460. M412447200 [pii]; 10.1074 / jbc.M412447200 [doi] [PubMed] [Google Scholar] 23. Вила-Санджурджо А., Сквайрс С.Л., Дальберг А.Е. Выделение мутантов, устойчивых к касугамицину, в 16 S рибосомной РНК Escherichia coli. J Mol Biol. 1999; 293: 1–8. 10.1006 / jmbi.1999.3160 ​​[doi]; S0022-2836 (99) -1 [pii] [PubMed] [Google Scholar] 24.Крамер Д.Л., Блэк ДжейДи, Метт Х., Бержерон Р.Дж., Портер С.В. Лизосомная секвестрация аналогов полиаминов в клетках яичников китайского хомячка, резистентных к ингибитору S-аденозилметиониндекарбоксилазы, CGP-48664. Cancer Res. 1998. 58: 3883–3890. [PubMed] [Google Scholar] 25. Шапиро А.Б., Фокс К., Ли П., Ян Ю.Д., Линг В. Функциональный внутриклеточный P-гликопротеин. Int J Cancer. 1998. 76: 857–864. 10.1002 / (SICI) 1097-0215 ​​(19980610) 76: 6 <857 :: AID-IJC15> 3.0.CO; 2- # [pii] [PubMed] [Google Scholar] 26. Sognier MA, Zhang Y, Eberle RL, Sweet KM, Altenberg GA, et al.Секвестрация доксорубицина в везикулах в линии клеток с множественной лекарственной устойчивостью (LZ-100). Biochem Pharmacol. 1994; 48: 391–401. [PubMed] [Google Scholar] 27. Легар Д., Ричард Д., Мухопадхьяй Р., Стиргоф Ю.Д., Розен Б.П. и др. АТФ-связывающий кассетный белок Leishmania PGPA является внутриклеточным переносчиком тиоловых металлов АТФазой. J Biol Chem. 2001; 276: 26301–26307. 10.1074 / jbc.M102351200 [doi]; M102351200 [pii] [PubMed] [Google Scholar] 28. Джайн Р., Гошал А., Мандал С., Шаха С. Запрещение клеточной поверхности лейшмании: роль во взаимодействии паразита и хозяина.Cell Microbiol. 2010; 12: 432–452. CMI1406 [pii]; 10.1111 / j.1462-5822.2009.01406.x [doi] [PubMed] [Google Scholar] 29. Велберн СК, Мерфи Н.Б. Гомологи Prohibitin и RACK активируются в трипаносомах, индуцированных к апоптозу, и в естественных терминально дифференцированных формах. Смерть клетки отличается. 1998. 5: 615–622. 10.1038 / sj.cdd.4400393 [doi] [PubMed] [Google Scholar] 30. Догерти МК, Моррисон Д.К. Разблокировка кодом 14-3-3. J Cell Sci. 2004; 117: 1875–1884. 10.1242 / jcs.01171 [doi]; 117/10/1875 [pii] [PubMed] [Google Scholar] 31.Brochu C, Haimeur A, Ouellette M. Белок теплового шока HSP70 и родственный белок теплового шока HSC70 способствуют толерантности к сурьме у простейших паразитов лейшмании. Шапероны клеточного стресса. 2004. 9: 294–303. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 32. Ву М, Тан ХМ. Гомолог Saccharomyces cerevisiae рибосомного белка S26. Ген. 1994; 150: 401–402. 0378-1119 (94) -8 [pii] [PubMed] [Google Scholar] 33. Ли Р., Лю XL, Ду QF, Чжан С., Луо Р.С. и др. [Протеомный анализ апоптотических клеток K562, индуцированных харрингтонином].Чжунхуа Сюэ Е Сюэ За Чжи. 2004. 25: 323–327. [PubMed] [Google Scholar] 34. Kusumawidjaja G, Kayed H, Giese N, Bauer A, Erkan M, et al. Основной фактор транскрипции 3 (BTF3) регулирует транскрипцию связанных с опухолью генов в раковых клетках поджелудочной железы. Cancer Biol Ther. 2007. 6: 367–376. 3704 [pii] [PubMed] [Google Scholar] 35. Brockstedt E, Otto A, Rickers A, Bommert K, Wittmann-Liebold B. Препаративный двумерный электрофорез высокого разрешения позволяет идентифицировать фактор транскрипции 3 РНК-полимеразы B как связанный с апоптозом белок в клетках лимфомы Беркитта человека BL60-2 линия.J. Protein Chem. 1999. 18: 225–231. [PubMed] [Google Scholar] 36. Амин М.А., Мацунага С., Ма Н, Таката Х., Йокояма М. и др. Фибрилларин, ядрышковый белок, необходим для нормальной морфологии ядра и клеточного роста в клетках HeLa. Biochem Biophys Res Commun. 2007. 360: 320–326. S0006-291X (07) 01235-1 [pii]; 10.1016 / j.bbrc.2007.06.092 [doi] [PubMed] [Google Scholar] 37. Янсен Р.П., Hurt EC, Керн Х., Лехтонен Х., Кармо-Фонсека М. и др. Эволюционная консервация человеческого ядрышкового белка фибрилларина и его функциональная экспрессия в дрожжах.J Cell Biol. 1991; 113: 715–729. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 38. Barth S, Shalem B, Hury A, Tkacz ID, Liang XH, et al. Выяснение роли C / D snoRNA в процессинге и модификации рРНК у Trypanosoma brucei. Эукариотическая клетка. 2008; 7: 86–101. EC.00215-07 [pii]; 10.1128 / EC.00215-07 [doi] [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 39. Толлервей Д., Лехтонен Х., Янсен Р., Керн Х., Hurt EC. Чувствительные к температуре мутации демонстрируют роль дрожжевого фибрилларина в процессинге пре-рРНК, метилировании пре-рРНК и сборке рибосом.Клетка. 1993; 72: 443–457. 0092-8674 (93) -F [pii] [PubMed] [Google Scholar] 40. de SW, Souto-Padron T. Параксиальное строение жгутика трипаносоматид. J Parasitol. 1980; 66: 229–236. [PubMed] [Google Scholar] 41. Overath P, Stierhof YD, Wiese M. Эндоцитоз и секреция у трипаносоматидных паразитов — бурное движение в кармане. Trends Cell Biol. 1997. 7: 27–33. S0962-8924 (97) 10046-0 [pii]; 10.1016 / S0962-8924 (97) 10046-0 [doi] [PubMed] [Google Scholar] 42. Vieira M, Rohloff P, Luo S, Cunha-e-Silva NL, de SW, et al.Роль H + -АТФазы P-типа в подкислении эндоцитарного пути Trypanosoma cruzi. Биохим Дж. 2005; 392: 467–474. BJ20051319 [pii]; 10.1042 / BJ20051319 [doi] [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 43. Магнит S, Blanchard JS. Молекулярное понимание действия и устойчивости аминогликозидов. Chem Rev.2005; 105: 477–498. 10.1021 / cr0301088 [doi] [PubMed] [Google Scholar] 44. Guha-Niyogi A, Sullivan DR, Turco SJ. Гликоконъюгированные структуры паразитических простейших. Гликобиология. 2001; 11: 45R – 59R.[PubMed] [Google Scholar] 45. Ilgoutz SC, McConville MJ. Функция и сборка поверхностного покрытия Leishmania. Int J Parasitol. 2001; 31: 899–908. S0020-7519 (01) 00197-7 [pii] [PubMed] [Google Scholar] 46. Чжэн З., Тветен Р.К., Менса-Уилмот К. Внутриклеточные гликозилфосфатидилинозиты накапливаются на эндосомах: токсичность альфа-токсина для Leishmania major. Эукариотическая клетка. 2005. 4: 556–566. 4/3/556 [pii]; 10.1128 / EC.4.3.556-566.2005 [doi] [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 47. Глейзер Т.А., Баатц Дж. Э., Крейшман Г. П., Муккада А. Дж.

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован.